羧甲基化殼聚糖季銨鹽與牛血清白蛋白的相互作用研究

李小芳，馮小強*，楊 聲，王廷璞

1天水師范學院 生化學院，天水 741001;2定西師范高等專科學校，定西 743000

血清白蛋白可以與許多內源和外源性化合物結合，藥物要通過血漿的儲運，才能到達受體部位產生藥效。因此，研究藥物分子與蛋白質間的相互作用具有重要的理論及實際意義［1，2］。殼聚糖作為一種天然的聚陽離子多糖，具有多種獨特的生物活性和功能，如活化淋巴細胞、增強機體免疫力、抗菌抑菌［3，4］、止血［5］、降低血酯和膽固醇以及抗腫瘤［6］等生物活性。在前期工作中，筆者利用殼聚糖分子結構的特性，制備了羧甲基化殼聚糖季銨鹽(CMCQA)，發現 CMCQA 對常見細菌 St.aureus、E.coli和真菌A.niger具有很好的抑制作用，且對E.coli和St.aureus的最小抑菌濃度值較殼聚糖降低了 5倍［7］，CMCQA有望在醫學領域有更為廣泛的應用。有關CMCQA與BSA之間相互作用的研究，目前尚未見報道。本實驗采用光譜法研究了CMCQA與BSA的作用機理，該研究為生命科學研究提供有用的信息。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

CMCQA(制備方法參見文獻［7］，羧甲基取代度為0.62，季銨鹽取代度為0.54);BSA(北京奧博星生物技術責任有限公司)，配成濃度為10-5mol/L的溶液，在4℃下保存備用;0.05 mol/L的 Tris-HCl(pH=7.2)緩沖溶液，用 0.01 mol/L NaCl溶液配制。RF-5301PC型熒光分光光度計(日本島津公司)。

1.2 CMCQA與BSA的作用

在10 mL容量瓶中均加入BSA溶液2.0 mL，然后加入不同濃度的CMCQA溶液，以Tris-HCl定容，作用1 h。以280 nm為激發波長，設定激發和發射狹縫寬度均為3 nm，記錄280～700 nm范圍內的熒光發射光譜。樣品池為1 cm ×1 cm石英吸收池。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

BSA是內源性熒光物質，其分子中的色氨酸、酪氨酸殘基均能發射熒光。在大多數情況下，認為蛋白質的熒光主要來自色氨酸殘基的貢獻，而且含色氨酸殘基的蛋白質的天然熒光及其變化直接反映了蛋白質中色氨酸殘基本身及其周圍環境的變化［8］。從圖1結果可以看出，隨著CMCQA濃度的增加，BSA的內源熒光強度有規律地降低，說明CMCQA對BSA的熒光具有猝滅作用，CMCQA與BSA之間發生了相互作用。

圖1 CMCQA對BSA作用的熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of BSA interacted with different concentrations of CMCQA

2.2 對BSA熒光猝滅方式的確定

表1為不同溫度下CMCQA對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程與猝滅常數。CMCQA對BSA的猝滅常數均遠遠大于200 L/mol，各類猝滅劑對生物大分子的kq最大值為2.0×1010L·mol-1·s-1［9］，可以初步判斷CMCQA對BSA的熒光猝滅屬于生成復合物的靜態猝滅。另外，動態與靜態猝滅也可依據不同溫度下的猝滅常數得以區別。對動態猝滅，溫度升高將有利于熒光體和熒光猝滅劑分子之間的有效碰撞，并可以促進電子的轉移過程，Ksv隨溫度的升高而增大;若是靜態猝滅，溫度升高，產物的穩定性降低，靜態猝滅常數Ksv減小［10］。在該研究體系中，CMCQA對BSA的熒光猝滅常數隨溫度的升高而減小，進一步表明CMCQA對BSA的熒光猝滅作用不是由擴散和碰撞引起的動態猝滅，而是生成復合物的靜態猝滅［11］。

表1 不同溫度下CMCQA對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer方程與猝滅常數Table 1 Stern-Volmer equations and quenching constants of BSA fluorescence quenching with CMCQA at different temperatures

2.3 結合常數和結合位點數

在CMCQA對BSA的熒光靜態猝滅過程中，假設生物大分子BSA有n個相同且獨立的結合位點，可與猝滅劑 CMCQA(稱為 Q)結合常數為 kA，則BSA與猝滅劑Q的配合反應可表示為:

當Q的濃度遠遠大于BSA濃度時，熒光體系的熒光強度和Q的濃度滿足以下關系:

根據方程(2)，lg(F0– F)/F～lgC(Q)曲線擬合可得到方程、平衡常數和結合位點數見表2所示。在室溫下，CMCQA與BSA的的結合常數KA為2.45×104L/mol，CMCQA與BSA的結合位點數等于1.04，考慮實驗誤差，認為一個CMCQA分子能與一個BSA分子結合形成配合物。結合常數隨溫度升高而減小，是因為當溫度升高，有利于結合產物的解離，使得平衡常數減小。

表2 不同溫度下CMCQA對BSA熒光猝滅對數方程及其參數Table 2 Logarithm equations and parameters of BSA fluorescence quenching with CMCQA at room temperatures

2.4 作用力類型的判定

以不同溫度下lnKA對1/T作圖，得到直線y=7.33+823.16 x(r=0.98833)，根據直線的斜率可以求出ΔH為-6.844 kJ/mol。同樣，根據熱力學公式［12］，求得CMCQA與BSA反應的有關熱力學參數(見表3)。因此，可認為CMCQA與BSA之間主要是通過靜電引力相互作用。反應的ΔH ＜0，表明反應為放熱反應，升高溫度將不利于向生成復合物的方向進行，所以升高溫度致使靜態猝滅結合常數減小，生成復合物的穩定性下降，進一步說明CMC-QA對BSA的猝滅是形成復合物導致靜態猝滅的過程。

表3 CMCQA與BSA結合的熱力學參數Table 3 Themodynamic parameters of the interaction between CMCQA and BSA

3 結論

CMCQA與BSA之間通過靜電引力相互作用，對BSA的猝滅過程為靜態猝滅。在室溫下，CMCQA與BSA的結合常數KA和結合位點數n分別為2.45×104L/mol和1.04。說明CMCQA對白蛋白的構象和分子能級都有明顯作用，很可能CMCQA是一類具有明顯的抗菌、抗病毒等活性的藥物。

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