蛋白印跡法檢測梅毒IgG抗體

鄒宇斌 林燕霞 郭健英 梁 平

1.廣東東莞市沙田醫院皮膚科，廣東東莞 523980；2.廣東東莞市沙田醫院檢驗科，廣東東莞 523980；3.廣東東莞市康華醫院皮膚科，廣東東莞 523000

梅毒是由梅毒螺旋體引起的一種性傳播疾病。不論出現假陽性還是假陰性結果，對患者本人及其親友都有重大影響，也容易引起醫療糾紛，因此對結果的報告必須慎重。國內實驗室診斷主要依賴血清學方法，一般為檢測梅毒非特異性抗體的TRUST和檢測梅毒特異性抗體的TPPA聯合篩選。WB是近二十余年新發展起來的一種先進檢測技術。本文以TRUST、TPPA作為對照，對蛋白印跡法檢測梅毒IgG抗體的若干問題作一探討。

1 材料與方法

1.1 血清來源

臨床確診的24例梅毒孕婦分娩后，取新生兒的靜脈血，共24份。

1.2 試劑和方法

取母親靜脈血進行TRUST和TPPA試驗；取新生兒靜脈血進行TRUST、TPPA和TP-IgG-WB試驗。試劑來源：①TRUST試劑：由上海榮盛生物技術有限公司生產；②TPPA試劑：由日本富士瑞必歐株式會社生產：③TP-IgG-WB試劑盒：由德國歐蒙醫學實驗室有限公司生產。試驗方法：①TRUST試驗方法：分別吸取50ul梅毒陽性對照和陰性對照均勻鋪加在紙卡的兩個圓圈中，取待檢血清50 uL置于紙卡的另一圓圈中，然后用專用滴管垂直分別滴加TRUST試劑1滴于上述血清中，按每分鐘100轉，搖動8 min，肉眼觀察。②TPPA試驗方法：用微量滴管將血清稀釋液滴入反應板第1孔中，共計100 μL，從第2孔至第4孔各滴25 μL。用微量移液管取樣品25 μL至第1孔中。然后從第1孔倍比稀釋至第4孔。用試劑盒中提供的滴管在第3孔中滴入25 μL未致敏顆粒，在第4孔中滴入25 μL致敏顆粒。置微型振蕩器振蕩30 s，置有蓋濕盒內，室溫（15～ 30℃）2 h后觀察結果。

1.3 蛋白印跡法

當硝酸纖維素薄膜（印跡膜）上出現兩條或兩條以上分子量為15Kda、17 Kda、45Kda和47Kda的多肽抗原條帶時，結果判斷為陽性。當印跡膜上無顯色帶或僅出現分子量為22 Kda多肽抗原條帶，結果為陰性。陽性結果不再根據條帶顯色強弱進行分級。

2 結果

24例梅毒孕婦新生兒血清標本TRUST18例陽性，TPPA和WB24例均為陽性（表1）。WB24例均檢測出針對15Kda、17Kda、45Kda和47Kda多肽抗原抗體。

表1 三種方法檢測結果比較

3 討論

梅毒螺旋體進入人體后首先刺激淋巴細胞產生IgM抗體，然后是IgG抗體。IgG抗體是體液免疫應答產生的主要抗體，是血清和細胞外液中最主要的抗體成分，在血清中含量最高，約占免疫球蛋白的75%。IgG抗體為四鏈單體，分子量150kda，相對較小，梅毒孕婦的IgG抗體可穿過胎盤滋養層，進入胎兒的血液循環，但如果新生兒已被感染，新生兒也有可能產生IgG抗體。因此本實驗檢測的IgG抗體有可能來自于母子雙方。

蛋白印跡法是一種診斷梅毒感染的特異性實驗，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的梅毒螺旋體多肽成分，轉移到印跡膜上，以非共價鍵形式吸附，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以印跡膜多肽作為抗原，與對應的梅毒特異性抗體起免疫反應，再與酶標記的第二抗體起反應，底物顯色后，則在印跡膜上相應的特異性多肽抗原位置出現顯色條帶。不同的研究者對采用蛋白印跡法所呈現的梅毒螺旋體特異性抗原區帶結果報道存在一定的差異，Robert[1]等報道印跡膜上針對分子量為14700（土600），17300（士700），44300（士600）和46900（士800）道爾頓的四條區帶為梅毒螺旋體特異性抗原帶，上述四條區帶中出現三條即可判斷結果為陽性；Fujimura等[2]認為分子量17 000、15 000、47 000、42 000道爾頓的4種抗原為梅毒特異性抗原。本文中采用的結果判斷標準與文獻報道的判斷標準不完全一致。

本次24份標本，TRUST只檢出18份陽性，有6份陰性。但是用WB檢測，24份均為陽性。TRUST檢測的并非梅毒特異性抗體，而是心磷脂抗體，并且標本溶血、血清不新鮮以及器皿污染等多種因素可以影響實驗結果，其特異性和敏感性均不理想。有報道在梅毒感染低危人群中，TRUST檢出特異性為96%[3]，敏感性為47.3%[4]。由于感染梅毒后心磷脂抗體出現晚于特異性梅毒抗體，晚期梅毒中此類抗體又逐漸轉陰，因此不適用于一、三期梅毒。

本次24份標本，TPPA與WB檢測均為陽性。這與韓曉峰等[5]的結果一致。TPPA是目前國內常用的梅毒血清學確診實驗，其敏感性、特異性均較高，被譽為“確證實驗”，但這種實驗并非完美無缺，仍可出現生物學假陽性[6-7]。TPPA采用的是純化的致病性梅毒螺旋體（Nichols株）菌體抗原，針對的是TP15、TP45的抗體[8]，所以當僅有TP17、TP47抗體時，TPPA無法出現陽性。針對TP15、TP45的抗體消失或降低時，又會導致TPPA的假陰性。有研究結果報道[9]，TP47為梅毒早期診斷指標，SATO等[10]亦報道TP15是活動期梅毒標志性抗體。蛋白印跡法印跡膜上吸附有15Kda、17Kda、45Kda和47Kda的多肽抗原條帶，避免了TPPA的固有缺陷。本實驗使用WB檢測，24例均檢測出針對15Kda、17Kda、45Kda和47Kda多肽抗原抗體，因此可以解釋為何24例標本兩方法檢測均為陽性。

蛋白印跡法結合了免疫學和生物化學的特點，特異性強，敏感性高，不需特殊的儀器設備，觀察結果不帶有主觀性，操作人員不需經過嚴格培訓和較多的經驗即可完成整個檢測過程，是理想的一種梅毒確認實驗。

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