改良消減雜交技術用以篩選差異表達非編碼小RNA的應用初探

王燕 彭莉萍 陳錦珍 劉星 羅鎮明 周天會

在過去的一段時間里，人們逐漸意識到非編碼RNA（Non-protein-cooding RNAs，ncRNA）的重要性。從蛋白質合成到基因表達的調控，ncRNA都扮演著重要的角色。作為一類非編碼蛋白質的RNA，nc-RNAs從RNA的水平上在生物體內發揮著基礎性功能，包括DNA復制、染色體的維持、轉錄調控、RNA的加工、mRNA的轉錄與穩定及蛋白質的翻譯［1］。它既包括microRNA［2］、siRNA、piRNA［3］等短片段長度的ncRNA，又包括長度在200 nt以上的ncRNA，它們在生物體內廣泛存在，通過RNA干擾、基因沉默、基因印記、DNA甲基化等機制調控著基因的表達。例如，一種含21-23 nt、在生物體內十分重要且豐度較高的RNA—microRNAs（miRNA），它們與多種蛋白質分子形成一種轉錄沉默復合體與靶mRNA的3' UTR（非編碼區）特異性結合從而抑制mRNA的表達或引起其降解，在基因的轉錄后調控中發揮著關鍵性的作用［4］；許多腫瘤的發生、發展與細胞內miRNA的異常表達有關［5］，因此腫瘤細胞內差異表達的小ncRNA可以作為腫瘤檢測和發生機制研究的一個重要方面。通過基因芯片技術和生物信息學方法可以檢出腫瘤細胞中特異表達的ncRNA從而為闡明腫瘤發生的分子機制提供新的試驗依據［6］。但是它只能依賴于已被發現鑒定ncRNA卻無法篩選出新的ncRNA。目前檢測新ncRNA的方法主要是構建編碼各類ncRNA特異cDNA文庫，然而這種檢測結果卻會被一些看家ncRNAs，如核糖體RNA、核內小RNA等嚴重干擾。而消減雜交技術可有效地降低甚至消除這種干擾。抑制性消減雜交技術（suppression subtractivehybridization，SSH）是Diatchenko等［7］1996年在抑制性PCR的基礎上建立起來的cDNA消減雜交方法，十分適用于克隆分析造成某種特殊表型的目的基因，是研究細胞產生變化的分子機理的有效方法。傳統的抑制性消減雜交技術操作步驟多、費時費力、易丟失信息。因此，在傳統消減雜交的基礎上，本試驗使用了QIAGEN公司的RNA分離方法，分離一定大小的RNA片段（主要是18-100 nt的小RNA），減小了非目的RNA的干擾，同時結合了Promega公司的生物素-磁珠親和分離技術，旨在探索一種快速檢測、有效篩選不同細胞中差異表達的非編碼小RNA的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞株MCF7和乳腺上皮細胞HBL100，購于中國科學院細胞庫（上海）。主要試劑PolyA TtractmRNA Isolation Systems Kit 購自Promega公司 ；PCR-Select cDNA Subtraction Kit購自Clontech公司；DIG-11-dUTP購于Roche公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司；pMD18-T Vector購于寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 MCF7和HBL100細胞于含有10％胎牛血清的RPMI-1640培養基中常規培養，待細胞長至90％左右后用胰酶消化并收集。

1.2.2 不同片段大小RNA的分離與富集 采用Trizol法提取總RNA，然后使用RNeasy MinElute Cleanup Kit試劑盒分離純化大片段（＞100 nt）RNA；用Mi-RNeasy Mini Kit試劑盒按照說明書步驟分離小片段（18-100 nt）RNA，電泳檢測分離富集小RNA效果。1.2.3 添加poly（A）尾 在微量離心管中依次加入10×poly（A）polymerase Buffer 5μL，MgCl25μL，DTT 5μL，0.1％ BAS 10μL，ATP0.5μL，RNA 10μmol/L，Poly（A）polymerase（0.2-2U/μL）5 U，ddH2O加至100μL，置于37℃水浴鍋中反應30min。1.2.4 含poly（A）尾RNA的分離與cDNA第一鏈的獲得

1.2.4.1 探針的退火 在上一步反應后的微量離心管內加入RNase-free ddH2O至終體積為500μL，于65℃加熱10min后加入3μL的Biotin-oligo（dT）探針和3μL的20×SSC，溫和搖勻，于室溫孵育至完全冷卻。

1.2.4.2 鏈霉親和素磁珠粒（SA-PMPS）的洗滌 震蕩盛裝SA-PMPS的玻璃管磁珠重懸至完全分散，將管置于磁架上捕獲SA-PMPS，小心移去上清液；用0.5×SSC（每次300μL）洗滌SA-PMPS 3次，每次洗后都用磁臺捕獲SA-PMPS并移去上清液，最后用100μL0.5×SSC 重懸洗后的 SA-PMPS。

1.2.4.3 RNA的捕獲、洗滌 將退火后的探針加入到含有SA-PMPS管中，室溫孵育10min，每1-2min翻轉管內液體使之混勻；然后用磁臺捕獲SAPMPS，小心移去上清液，再用0.1×SSC（每次300μL）洗滌磁珠4次。將最后一次所得SA-PMPS重懸于 100μL RNase-free ddH2O 中。

1.2.4.4 反轉錄獲得cDNA第一鏈 在離心管內加入RNA 2μL，Oligo（dT）primer 2μL，5×primer Script Buffer 8μL，dNTP 8μL，Biotin-dUTP 1μL，Primer-Script Reverse Transcriptase（200U/μL）1μL，RNease-free ddH2O加至40μL各反應液，混勻，42℃水浴中反應1h。

1.2.4.5 單鏈cDNA的制備 反轉錄后將離心管放于沸水中加熱1min，再置于冰水中聚然冷卻1min，迅速轉移離心管至磁架上，小心吸去上清液。取下離心管，加入100μL0.1×SSC重懸磁珠，重復以上操作，即獲得單鏈cDNA。

1.2.5 消減雜交 取30μL 制備好的SW480cDNA探針于一支RNease-free的離心管中，加入30μL MCF7的RNA分離液和13μL 20×SSC，混勻后，蓋上蓋子并用封口膜封住管口，放置于分子雜交儀中，68℃雜交22h。

1.2.6 雜交液的純化 將雜交后的離心管置于磁架上，小心吸取上清液于另一支RNease-free的離心管中。取一支MiRNeasy Mini 柱子按照上述RNA分離時的相同步驟操作得到目的RNA片段。

1.2.7 目的RNA的RT-PCR和雜交效果的驗證

1.2.7.1 目的RNA的反轉錄 按poly（A）尾添加的反應體系將所得RNA片段加上poly（A）尾后采用smart cDNA合成方法合成目的RNA片段的cDNA。反應體系中加入反轉錄酶 1μL，引物 SⅠ 2μL，引 物 SⅡ 2μL，5×Buffer 10μL，dNTP 4μL，RNA 30μL，RNase-free ddH2O 加至 50μL 各試劑，混勻，42℃水浴1h。其中引物SⅠ和SⅡ的序列分別為：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3'和5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d（T）30N-1N-3'（N=A，G，C 或 T；N-1=A，G或C）。

1.2.7.2 產物PCR 反應結束后，在離心管內加入各反應液進行巢式PCR。其中引物 SⅢ序列為：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，第一次 PCR 反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性15s，68℃退火延伸6min，進行30個循環；最后72℃保溫10min。第二次PCR時取第一次PCR反應產物1μL，引物1和引物2分別為：5'-GTATCAACGCAGAGT-3'和5'-CGAGGCGGCCGACATG-3'，反應條件與第一次PCR相同，進行11個循環。取5μL PCR產物與 5μL Loading Buffer（含0.2％ GoldView）混 勻 于1％的瓊脂糖凝膠上電泳（101 V、70mA）約15-20min，觀察雜交結果。

1.2.7.3 消減效果的驗證 為了驗證兩組樣品已雜交完全，以U6為內參。U6是一種核內小RNA，在真核生物細胞普遍存在，因富含尿嘧啶（U）而得名。它全長106 nt，設計其PCR上（a）、下游（b）引物分別為：5'-GAGCGAAGCCGTCGTGTATA-3'和5'-TATACCTTGCGAAGTGCTTA-3'。取消減前（4組樣品）和消減后（4組樣品）的產物按下述程序配置PCR 反應體系 ：10×PCR Buffer 10μL ；引物 a 2μL ；引物 b 2μL；dNTP 10μL；Ex Taq聚合酶 1μL；cDNA 30μL；ddH2O 加至 100μL。PCR 反應條件為 ：94℃預變性5min；94℃變性15s，68℃退火延伸6min，進行18、23、28、33個循環；最后72℃保溫10min。反應后取 5μL PCR 產物與 5μL Loading Buffer混勻于1％的瓊脂糖凝膠上電泳（101 V、70mA）15-20min。

1.2.8 T/A克隆 按常規方法將純化的PCR產物插入pUCm-T載體，轉化大腸桿菌，經藍白斑篩選，挑取陽性克隆，提取質粒，PCR擴增插入片段。

1.2.9 反向cDNA斑點雜交 純化上述PCR產物，經NaOH變性后分兩個陣列平行點樣于兩張尼龍膜上，每個點所占尼龍膜的面積為0.5cm×0.5cm，在每個點的中心位置上點加濃縮的PCR產物約200ng（1μL）。經紫外交聯固定于尼龍膜上。用DIG-11-dUTP按試劑盒說明標記探針，探針為tester和driver的 cDNA。

然后經過預雜交、封閉、洗膜等步驟，把尼龍膜分別和兩種探針共孵育，再進行洗膜、封閉、洗膜，滴加生物素標記鼠抗地高辛孵育后洗膜，經DAB暗室顯色至滿意程度。挑選兩張膜上顯色有差異的點。

1.2.10 測序及同源性分析 挑取經驗證的陽性克隆，送Invitrogen公司測序。利用Blastn軟件將所得結果與GenBank中的收錄核苷酸序列進行同源比較。

2 結果

2.1 RNA 分離效果的鑒定

RNA試劑盒分離后的目標RNA樣品經10％聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示SW480和 SW620的Total RNA經試劑盒提取分離后，目標RNA片段得到了有效地濃縮和富集（圖1）。

圖1 經10％PAGE的RNA分離片段

2.2 雜交效果的驗證

以U6為內參對雜交前后的產物進行不同循環的PCR擴增，電泳結果（圖2）顯示，消減后的產物經過18、23和28次循環擴增后在100 nt左右均未顯示明顯的特異性條帶，說明消減效果較好。

圖2 驗證消減效果的瓊脂糖凝膠電泳

2.3 雜交產物的擴增

雜交產物巢式PCR擴增中，第一次和第二次PCR均在100 nt左右顯示特異性條帶，且第二次PCR與第一次相比條帶更窄，特異性較高，因此可以確定雜交產物中含有目標RNA片段（圖3）。

2.4 反向cDNA斑點雜交結果

將陽性克隆的PCR產物平行點在兩張帶正電的尼龍膜上，分別與地高辛標記的tester和driver cDNA探針進行反向斑點雜交，試驗重復3次，經軟件分析挑選灰度值相差3倍及以上的點定為有差異的克隆，部分結果見圖4。

圖3 巢式PCR擴增雜交產物的瓊脂糖凝膠電泳

圖4 反向斑點雜交部分結果

3 討論

人類基因組中含有約105個基因，但并非在每個細胞中都可以表達。基因表達具有選擇性和時空性，正因為如此，機體中各類細胞才會呈現出形態和功能的差異。許多疾病的發生與發展都同細胞內基因的異常表達密切相關。腫瘤細胞表型的改變就是其中一個典型的例子。惡性腫瘤具有許多不同于正常細胞的明顯特征，如轉移性、浸潤性和表達譜的改變等。其中癌細胞的轉移主要涉及兩種基因的改變：轉移基因和轉移抑制基因［8］。因此，克隆這些細胞中差異表達的基因成為了表型研究和疾病治療的前提。mRNA差異顯示技術（mRNA differential display，DD）［9］與代表性差異分析技術（representional difference analysis，RAD）［10］在差異表達mRNA的檢測中已廣泛運用，但是都還存在缺點：DD技術測得的結果假陽性率高，而RAD技術的操作繁瑣。在此基礎上建立的抑制性消減雜交技術（suppression subtractivehybridization，SSH）［7］克服了DD和RAD技術的缺點而得到普遍運用。本試驗以乳腺癌細胞MCF7與其對照細胞HBL100為材料，通過消減雜交和PCR技術找到了兩類細胞差異表達的非編碼小RNA，為癌細胞轉化機制的研究提供了試驗依據。試驗中結合了Promega公司的RNA分離技術，不僅收集到了特異性片段、達到了濃縮和富集的效果而且簡化了試驗操作；利用Biotinoligo（dT）和生物素-磁珠親和技術，直接在結合了磁珠的oligo（dT）上進行RT制備cDNA探針與提取的RNA雜交，省去了傳統消減雜交技術中制備雙鏈cDNA再同探針雜交的操作，在取得相同效果的基礎上再次簡化了試驗步驟；在擴增雜交產物時采取巢式PCR技術，幾乎或完全消除了引物配對特異性不強造成的非特異性擴增污染，提高了產物的特異性，是一種改良的消減雜交技術。此外，試驗中制備的cDNA探針在與RNA雜交后可以回收利用，只要將結合有RNA的磁珠用蒸餾水洗滌3-4次除去RNA即得到單鏈cDNA。可以利用這種探針進行相關的檢測。

4 結論

利用這種改良的消減雜交技術，成功地分離到一批在MCF和HBL100細胞中差異表達的非編碼小RNA，較之傳統的抑制消減雜交技術更快速、操作更簡便，因此試驗中建立的這種方法可以應用于不同組織、細胞中差異表達非編碼小RNA的分離與鑒定。

［1］ Eddy SR.Non-coding RNA genes and themodern RNA world［J］.Genet, 2001, 2：919-929.

［2］ Kozomara A, Griffiths-Jones S.miRBase：integratingmicroRNA annotation and deep-sequencing data.Nucleic Acids Res, 2011, 39（suppl 1）：152-157.

［3］ Kim VN, Han J, Siomi MC.Biogenesis of small RNAs in animals［J］.Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10：126-139.

［4］ Westholm JO, Lai EC.Mirtrons：microRNA biogenesis via splicing［J］.Biochimie, 2011, 93：1897-1904.

［5］ Mclver SC, Roman SD, Nixon B, et al.miRNA andmammalianmale germ cells［J］.Human Reproduction Update, 2012, 18（1）：44-59.

［6］ 黃秀芳, 邵建永, 顏黎栩, 等.乳腺癌差異表達的MicroRNA的篩選研究［J］.中山大學學報, 2009, 1（30）：69-77.

［7］ Diachenko L, Lau YC, Campbell AP, et al.Suppression subtractivehybridization：amethod for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries［J］.Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93（12）：6025-6030.

［8］ 王濤, 陸應麟, 劉爽, 等.抑制消減雜交技術在腫瘤轉移調控研究中的應用［J］.生物技術通訊, 2000, 11（3）：165-170.

［9］ Liang P, Averboukh L, Keyomarsi K, et al.Differential display and cloning ofmessenger RNA fromhuman breast cancer versusmammary epithelial cells［J］.Cancer Res, 1992, 52：6966.

［10］ Lisitsyn N, Lisitsyn L, Wigler M, et al.Cloning the differences between two complex genomes［J］.Science, 1993, 259（509）：946.