植物響應低磷脅迫的功能基因組研究進展

邢國芳 郭平毅

磷作為植物生長發育所必需的大量元素之一，幾乎參與了植物所有的生命活動過程。土壤中的磷大多數以無效態的形式存在，而能被植物吸收利用的有效態的磷含量通常在1μmol/L左右，遠不能滿足植物獲取充足磷營養的需求，土壤有效供磷不足已經成為我國乃至全世界農業生產中限制谷物產量的主要因素之一。據統計，全世界130億hm2的耕地中，缺磷耕地占43％［1］，我國耕地中約有2/3的土壤缺磷［2］。另外，由于磷肥是不可再生資源，據估計全世界磷礦儲藏量在未來的幾十年將被耗盡［3］，而且，大量施用磷肥，將消耗大量資源，增加農業生產成本，與此同時還將帶來環境污染。因此，在世界范圍內，缺磷已經成為限制作物生長和影響作物產量的主要非生物脅迫之一［4］。

基因組學（genomics）是20世紀90年代以來興起的一門新興學科，是指對生物的所有基因進行基因組作圖，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一門科學［5］。功能基因組學（functional genomics）又稱后基因組學（postgenomics），是在基因組學的基礎上通過新的技術和手段（如差減雜交技術、cDNA芯片、高通量測序和蛋白質雙向電泳技術等）全面系統地解析基因的功能，其研究的主要內容包括基因功能的發現、基因組的表達及時空調控及蛋白質組［6］。

應用功能基因組學技術闡明植物對低磷脅迫響應的分子機制，已成為科學領域的一大熱點，近期很多科研機構開展了植物耐低磷脅迫應答相關的功能基因組學研究，這無疑能促進人們對于植物耐低磷脅迫機制的系統認識，也更有助于作物耐低磷脅迫的分子育種。

1 植物適應低磷脅迫的形態變化

當外界的磷濃度低于一定水平時，植物就會適時地作出一些反應，這種適應性變化能夠提高植物的磷吸收并加強體內磷的代謝能力，從而提高磷的利用效率。例如，植物在缺磷條件下，主根的生長受到抑制，而側根的數量和長度增加，從而擴大了根系對土壤磷的吸收面積，提高其對磷的吸收效率，進而提高植物對磷脅迫的適應能力［7］。缺磷可以促進根毛的形成，使根毛的長度和密度增加，以促進根系對磷的吸收［8］，相關報道表明植物需磷量的60％是由根毛吸收的［9］。缺磷還可導致植物根系構型發生改變，使基部根的向地性反應減弱，根系分布變淺，根系生長角度變小，從而增大了在土壤有效磷含量較高區域的根系分布密度，進而提高了根系對磷的吸收效率［10］。另外，缺磷還能影響植物光合作用和碳水化合物的分配，導致在低磷條件下，植物的根冠比增加［11，12］，對磷利用率高效的物種（如小麥、燕麥）的根冠比普遍大于磷低效的物種（如洋蔥、番茄和大豆），即使同一物種在低磷條件下，根系的生長量也會較正常磷水平條件下明顯增加［13］。最后，在缺磷條件下植物的地上部分也表現出明顯的癥狀，如植株矮小，生物量降低，葉片顏色變紫，花青素積累，抗性減弱，植物的營養周期變短，提前開花完成生活史等［14］。此外，一些植物如豆科植物白羽扇豆在遇到低磷脅迫時，可以形成排根（又稱簇生根），來提高植物根系與土壤的接觸面積，從而提高根系對磷的吸收能力［15，16］。

2 低磷脅迫前后基因的差異表達譜

植物體對低磷響應的一系列適應性變化過程是某些基因時空表達的結果。因此，許多研究者構建磷脅迫誘導的表達譜，對磷脅迫誘導的基因進行高通量的深入分析和功能研究，相繼在擬南芥、水稻、玉米和大豆等作物中發現低磷脅迫后大量的基因差異表達，而且差異基因幾乎涉及到生理生化的所有途經［17-20］。Wu 等［21］和 Misson 等［22］分別采用Microarray和Affymetrix芯片技術在擬南芥中發現：磷脅迫前后有相當一部分基因的表達發生了改變，且存在時空表達差異性，差異基因幾乎涉及到擬南芥所有的代謝途徑。Wasaki等［23］采用cDNAarray的方法對水稻磷脅迫不同時期的表達譜分析發現：磷脅迫后糖酵解途經、碳代謝途徑、脂代謝途經、硫脂的合成和代謝，以及細胞壁的組分，金屬離子的代謝的相關基因的表達均發生了變化。Morcuende等［17］結合擬南芥Affymetrix芯片和qRT-PCR表達分析以及部分代謝關鍵酶活性的測定發現，1000個以上的基因受到磷水平變化的調節。該研究還表明轉錄水平的變化并不必然導致蛋白或酶學水平的改變。綜合轉錄組的研究結果，根據低磷脅迫響應基因的表達模式，可以將它們分成兩類：一類是早期快速響應基因，研究發現在擬南芥中，低磷脅迫24-72d后，磷濃度發生變化，但植株的生物量未受到影響，所以這段時間內誘導表達的基因稱為早期響應基因。這些基因多數不是低磷脅迫的特異響應基因，且在其啟動子區，PHO和TATA-box元件出現的頻率較高［14］；另一類是低磷脅迫晚期響應基因，其中大部分是隨著低磷脅迫的加劇而誘導表達的，是與低磷脅迫下植物形態、生理和代謝反應相關的基因［14］。近年來蛋白質組學的發展也為磷脅迫研究提供了新的手段。張舉仁教授實驗室采用2-D技術結合質譜鑒定了玉米缺磷脅迫17d后蛋白水平的變化發現，差異蛋白涉及碳代謝、激素合成，細胞周期和信號轉導等途徑，并進一步通過突變體分析發現，在低磷條件下，根系中有13.6％的蛋白存在質和量的顯著差異［24，25］。馮萬軍等［26］采用蛋白質雙向電泳在小麥中檢測到1144個蛋白點，有 87個在磷脅迫前后發生了表達變化，其中39個通過質譜技術鑒定涉及到代謝、轉錄調控等功能類別。這些結果也進一步印證了轉錄水平的研究結果。

3 磷脅迫前后差異表達基因的功能類別

綜合前人在轉錄和蛋白質組上的研究結果發現，磷脅迫相關的基因涉及到各個功能類別，包括代謝、發育過程、轉錄和翻譯、脅迫響應等多個分子生物學途徑，其中代謝相關基因為最多。例如，Hernández等［20］對菜豆在缺磷和富磷條件下進行功能基因組學研究發現，有126個基因差異表達，其中上調表達的基因有78個，編碼產物分別參與次生代謝途徑/脅迫與防御反應（23％）、磷循環、碳代謝、氮代謝、酯類代謝和氨基酸/蛋白質合成和降解（24％）、膜蛋白/胞內和胞間運輸（13％）和細胞結構/細胞周期/發育（8％），功能未知的基因占9％。缺磷的根中下調表達的基因有48個，最大的一類基因（11個，23％）參與氨基酸和蛋白質代謝，參與C/N代謝途徑的有5個基因（10％），屬于轉運/膜蛋白類和細胞結構/細胞周期/發育蛋白類的基因分別有9個（19％）和7個（15％），參與調控/信號轉導和次生代謝/防御途徑的基因分別占8％和6％。在過去的10年間，一些對低磷脅迫響應基因相繼被分離鑒定。例如，Wasaki 等［23］在白羽扇豆中發現，酸性磷酸酶（ACP）基因在低磷脅迫下的排根中表達，其活性增強有利于土壤中有機磷的分解。分離出了負責植物體中磷的吸收和轉運的磷轉運子，其主要包括Pht1、Pht2 Pht3、Pho1和Pho2五大家族成員［27，28］、各種低磷脅迫反應的調控基因-轉錄因子基因如MYB類轉錄因子PHR1，PHR2，受低磷誘導表達的WRKY類轉錄因子WRKY75，鋅指類轉錄因子ZAT6和BHLH類轉錄因子BHLH32［29-33］，以及與磷吸收利用有關的核酸酶（RNases）基因等［34］。這些基因通過復雜的調控網絡參與植物對低磷的應答。

4 植物響應低磷脅迫的基因表達網絡

植物通過體內的信號感受器獲得土壤有效磷缺乏的低磷脅迫信號，通過復雜的信號轉導，啟動體內與磷脅迫相關的基因表達，通過調控植物體內的生理生化過程，最終表現出一系列與低磷脅迫有關的形態特征，如地下部根系的變化-主根變短，側根、根毛的數目和密度增加，根冠比增加以及地上部的變化-花青素的積累增加等。Schachtman等［35］總結了目前已經鑒定的與低磷反應相關的基因，包括激素受體、轉錄因子、磷轉運蛋白及小RNA等（圖1）。這些基因的產物有的參與了低磷反應信號轉導過程，如細胞分裂素受體CRE1磷濃度變化的指示劑；轉錄因子PHR1是目前發現的低磷反應的關鍵調控因子［36］；編碼z2型磷脂酶D的基因（PLDz2）既參與低磷條件下植物根系的形態發生，又參與植物體中脂類成分的轉換；泛素連接酶PHO2、小RNA基因miR399以及磷轉運蛋白基因等是低磷反應調控網絡中的下游基因，它們共同維持低磷條件下植物體磷穩態；SIZ1是一個植物小泛素樣修飾子（small ubiquitin-likemodifier，SUMO），即一個E3連接酶，是控制低磷反應的關鍵因子，低磷脅迫時可以促使PHR1蛋白發生SUMO化，從而激活一系列低磷反應，并且負調控一些低磷響應的下游基因如PSI、At4等的表達［37］。目前認為以轉錄因子PHR1為中心，包括小RNA及蛋白泛素化途徑，是迄今為止首次發現的磷脅迫信號的轉錄后調控途徑［38］。

圖1 植物體在正常及缺磷條件下的調控網絡系統［35］

5 非編碼RNA參與的植物耐低磷脅迫途徑

目前關于非編碼RNA與植物耐低磷脅迫的研究報道較少，且主要集中于模式植物擬南芥。

5.1 小分子非編碼RNA參與的低磷脅迫信號機制

Bari等［39］報道，miR399作為一種長距離信號調節植株體內的磷穩態，并通過系統分析PHO2、miR399和PHR1基因在磷脅迫誘導后的表達模式，提出了它們之間的上下游調控網絡（圖2）。推測miR399的靶基因是PHO2（AtUBC24），其編碼泛素化蛋白降解途徑中的泛素連接酶E2［38-40］。miR399由核基因編碼，成熟的miRNA399進入細胞質后與PHO2mRNA 3'端非編碼區的互補序列結合，誘發靶mRNA降解或抑制蛋白質翻譯。磷饑餓時誘導miRNA399表達，同時E2連接酶基因UBC24的表達受到抑制，而供磷恢復后miR399的表達水平則快速下降，使得UBC24的表達抑制被解除，這樣就提供了一個機制，即供磷水平在轉錄水平上調節miR399的表達豐度，進而調控植物體內與磷分配相關基因的表達，從而維持植物體內的磷穩態。Pant等［41］通過微嫁接試驗，進一步證實miR399是通過韌皮部從地上部莖轉運到地下部根系，作為一種長距離信號調節植物體磷穩態。我們在玉米中研究發現小分析非編碼RNAmiR399以及miR447在磷脅迫后迅速發生差異表達，表明其參與玉米對低磷脅迫的響應（結果未發表）。

5.2 長鏈非編碼RNA（lncRNA）與植物耐低磷脅迫的關系

有資料顯示，lncRNA TPSI1/Mt4基因家族成員參與了擬南芥植株體內磷的分配和磷穩態調控［42］。在磷饑餓條件下，家族成員At4在維管組織中被誘導表達，在低磷條件下，at4根吸收磷的速度下降而向地上部的轉運速率增加，結果導致根中無機磷含量降低。該家族的另一成員AtIPS1，受磷饑餓誘導表達，且在野生型中表現為組成型表達；而在富磷環境下的pho1突變體內，AtIPS1的表達則僅限于根的內皮層中。表明其控制植株體內磷分配的系統信號是以負調控的方式發揮作用［42］。

隨著基因芯片及高通量測序技術的發展，一些新的低磷脅迫相關的非編碼RNA的發現，為這一領域的研究提供了更詳實的證據［43］。miR399包括多個家族成員，在玉米和水稻中分別有10和11個。miR399及其靶基因PHO2/UBC24在單子葉和雙子葉植物之間相當保守［44］。

6 植物激素參與低磷脅迫信號的傳導

目前認為植物激素細胞分裂素（CTK）參與了植物對體內磷營養信號通路的感應［45］，在低磷條件下植物體內CTK含量顯著降低，外源施加CTK可以抑制低磷響應基因IPS1、At4等基因的表達［46］。生長素也可能在植物根系響應低磷反應中起重要作用，據報道低磷脅迫增加擬南芥根系對生長素的敏感性，并且外源生長素處理可以使高磷植株表現出低磷條件下的形態特征［47］。徐中平［48］發現，低磷使得玉米植株根系的構型發生了改變，這與生長素和玉米素在根部的水平和分布以及兩種激素濃度比例的變化有關。Borch等［49］發現，在低磷脅迫條件下，菜豆根系中乙烯含量增加且表型發生變化，乙烯還參與低磷脅迫條件下擬南芥主根的伸長和根毛的形成［50］。此外，ABA和赤霉素等植物激素、糖信號和包括JA在內的生物逆境調節途徑可能也參與了磷脅迫基因的調節。

圖 2miRNA399介導的磷脅迫信號轉導途徑［38］

7 展望

植物在低磷脅迫條件下，體內的新陳代謝、生理生化反應發生改變，進而導致根系以及地上部發生變化，這些適應性改變有利于提高植物對土壤中磷的吸收利用效率，降低植物對低磷脅迫所造成的傷害。近年來，一些與磷吸收和利用以及低磷脅迫下根系發育相關的突變體被篩選出來，低磷脅迫導致根系發育異常的分子機制研究取得了很大進展。研究發現相關蛋白、激素、轉錄因子基因通過復雜的代謝網絡調控低磷脅迫下植物的生長發育，但這一復雜的基因調控網絡目前尚未解析，采用轉錄組測序以及功能基因組研究技術，將有助于深入解析相關基因的功能及其參與的代謝網絡的調控機制。另外，由于目前對于低磷脅迫分子機制的研究多集中于模式植物擬南芥中，在相關作物中的研究相對較少，相信借助于擬南芥的研究成果，解析植物耐低磷的分子機制，克隆重要候選基因，對于培育磷高效的作物新品種將具有深遠的意義。

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