黑曲霉葡萄糖氧化酶高產基因工程菌研究進展

劉瑜 李丕武

1 葡萄糖氧化酶簡介

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）最早在黑曲霉的提取物中發現［1］，系統名稱為β-D-葡萄糖：氧1-氧化還原酶（EC 1.1.3.4）。它能夠催化β-D-葡萄糖被氧氣氧化成葡萄糖酸-δ-內酯，并生成過氧化氫［2］。生成的葡萄糖 -δ-內酯隨后自發水解［2］或者在內酯酶的作用下水解成葡萄糖酸［3］。相關反應，如圖1所示。

圖1 葡萄糖氧化酶酶促反應［4］

GOD應用廣泛，可用于葡萄糖傳感器制造［5］、面粉添加劑［6］、葡萄糖酸及其鹽生產［7］和生物燃料電池［8］等領域。因此，尋求更有效的GOD的生產方法具有重要的現實意義。目前生產GOD的微生物有黑曲霉（Aspergillus niger）［9］、尼琦青霉（Penicillium amagasakiense）［10］、變幻青霉（Penicillium variabile）［11］和軟毛青霉（Penicillium puberulum）［12］等，其中以黑曲霉最為重要。

2 黑曲霉GOD結構性質簡介

黑曲霉GOD含有兩個相同的亞基，兩個亞基通過兩個二硫鍵相結合［13］，每個亞基含有一個緊密非共價結合的 FAD 分子［14］。Swoboda 和 Massey［15］測得相對分子質量為18.6kD，熱變性或化學變性（8mol/L尿素）后測出每分子含有1個巰基和兩個二硫鍵，酶分子糖含量為16.5％（±0.8％），如此高的糖含量使得黑曲霉GOD具有很多不尋常的性質：100℃時不發生沉淀；對0.75％的十二烷基硫酸鈉（SDS）穩定；5％的三氯乙酸只能使其緩慢沉淀；在水中的溶解度較高，需要較高濃度的鹽才能沉淀（80％-90％ 硫酸銨）。Nakamura和 Fujiki［16］測定其含有的糖主要是甘露糖、葡萄糖和己糖胺。Kalisz等［17］測得最適pH5.5-6.0，且糖鏈對酶的結構、穩定性和活力不起主要作用。1989年，Kriechbaum等［18］首先克隆了黑曲霉NRRL-3的GOD基因，該基因由1 815個堿基對組成，編碼一個亞基的605個氨基酸殘基。由于成熟的酶的一個亞基含有584個氨基酸殘基，因此確定有21個氨基酸殘基組成了信號序列。1993年，Hecht等［19］得到了分辨率為2.3 ?的部分脫糖基的黑曲霉GOD晶體結構模型。1999年，Wohlfahrt等［20］獲得了黑曲霉GOD1.9?的結構，從結構上解釋了酶對底物的專一性、D-葡萄烯糖的競爭性抑制、鹵素離子的抑制作用等性質。2011年，Kommoju等［21］得到了該酶分辨率為1.2?的結構，并以氯離子代替氧探索了氧激活位點。

3 黑曲霉GOD生產進展

3.1 黑曲霉發酵生產GOD

黑曲霉發酵是傳統的GOD生產方法，也是目前為止被研究得最多的方法。近年來研究成果主要有：Liu等［22］利用臺式生物反應器對黑曲霉發酵生產GOD進行了響應面優化，并對菌絲體生長、GOD的生產和葡萄糖的消耗進行了模擬，得到的模擬結果能夠較好地與試驗結果吻合。 Mirón等［23］研究了碳源和氮源對黑曲霉發酵生產GOD的共同作用，著重針對于NP2和N2P交互作用進行了因素試驗，結果表明無機氮源（硝基氮）比有機氮源（蛋白胨）更適合產酶，有機氮源能夠促進菌體生長而不利于葡萄糖轉化成葡萄糖酸；確定了最佳碳源和氮源比例，使酶活從1.8U/mL提高到12U/mL。Gera等［24］研究了葡萄糖、蔗糖和棉子糖對黑曲霉NRRL326產酶的影響，表明蔗糖效果最好（4.5U/mL），但當濃度大于20g/L時對產酶有明顯的抑制作用。Bankar等［25］分兩步對產酶條件進行了優化，最終確定碳酸鈣、蛋白胨和硫酸鎂為顯著因素，并使酶活力從0.009 93U/mL提高到了2.05U/mL，培養時間從96h降低到72h。Khattab和Bazaraa［26］采用先誘變后原生質體融合的方法以黑曲霉FS-3（發酵液酶活力15.9U/mL）為出發菌株篩選高產菌株，得到了融合子C-18，胞外酶活力達62.7U/mL。

從以上資料可以看出，目前的研究集中于新菌株的篩選以及方法的優化，并獲得發酵過程中的動力學模型。由于黑曲霉產酶不高，且大部分的酶存在于細胞壁和胞內［27］；分離純化困難，而且該方法經過多年的研究，產量提高的潛力相當有限，因此需要利用新的方法提高GOD的產量。

3.2 基因工程菌發酵生產GOD

利用基因工程的方法解決黑曲霉發酵產酶不高的問題，策略有兩種：第一是通過增加黑曲霉中的GOD基因的拷貝數來增加產量；第二是對GOD基因進行異源表達，使基因擺脫原來調控系統的限制，在人為構建的表達盒中得到高效的表達。

3.2.1 黑曲霉基因工程菌的構建與發酵 絲狀真菌被用來表達內源和外源蛋白具有以下優勢：真菌能夠大量的分泌蛋白，可以避免蛋白在細胞內積聚可能會對細胞造成毒害的問題。并且，由于其發酵技術較為成熟，絲狀真菌可以在廉價的培養基中大量的生長，在優化的生長條件下，自身蛋白能達到較高的分泌水平；另外，作為一種真核生物，其所具有的翻譯后加工機制在生產需要復雜翻譯后修飾的蛋白方面具有額外的優勢。最后，很多重要的工業絲狀真菌如黑曲霉、米曲霉、里氏木霉、頂頭孢霉和產黃青霉本身為GRAS微生物，在生產藥用蛋白和食品用蛋白時具有良好的生物安全性［28］。

目前，在產GOD黑曲霉基因工程菌構建方面已經完成的主要工作如表1所示。

表1 已報道的產GOD基因工程黑曲霉的構建

人們還對黑曲霉工程菌的培養做了很多研究工作。 El-Enshas等［32］研 究 了 NRRL-3（GOD3-18）在搖瓶和攪拌罐式反應器培養時菌絲形態及其與GOD分泌之間的關系發現，小而致密的菌絲球有利于GOD的分泌，推測原因是小的菌絲球有利于營養物質的傳遞。搖瓶培養時形成的菌絲球明顯分層并中空，而攪拌罐式反應器中菌絲球的形成分為兩步。隨后他又研究了非葡萄糖碳源對NRRL-3（GOD3-18）中GpdA啟動子控制下GOD生產的影響，指出在碳源為葡萄糖、果糖和木糖時，GpdA啟動子控制下的GOD的合成同細胞生長嚴格耦聯；在5 L攪拌罐式反應器發酵120h后，木糖作為碳源時GOD總活力、比活力和胞外比例分別為626.0 μKat/L、42.0 μKat/CDW（CDW：細胞干重）和87.0％，優于或接近使用葡萄糖為碳源的水平（234.0 μKat/L、48.0 μKat/CDW和89.0％），并且不形成葡萄糖酸［33］。

提高黑曲霉GOD基因的劑量能夠使GOD表達水平相對出發菌株有較大提高，但是最終效果同傳統菌種改造方法差別不大，對于工業應用缺乏足夠吸引力。其可能原因是絲狀真菌表達系統不夠成熟，需要絲狀真菌遺傳學和細胞生物學理論的發展。

3.2.2 釀酒酵母表達黑曲霉GOD 釀酒酵母是應用最早的真核表達系統，其具有的一些特點使其成為表達工業和醫學所用外源蛋白的重要工具。首先，作為一種公認安全的微生物，將其用于藥物蛋白的生產已為人們所高度接受。相比之下，大腸桿菌表達的外源蛋白可能會含有內毒素，哺乳動物細胞可能會含有致瘤或病毒DNA。其次，釀酒酵母可以在簡單的培養基上快速的生長，并達到很高的細胞密度。最后，其遺傳學特性比其他任何真核生物的研究都更加透徹，可以像大腸桿菌一樣方便的進行操作。釀酒酵母是第一種用于黑曲霉GOD外源表達的微生物，早在1990年，Frederick等［34］首先用釀酒酵母GRF181表達了黑曲霉GOD基因。已發表的以釀酒酵母為黑曲霉GOD表達宿主的主要文獻列于表2。

表2 釀酒酵母表達黑曲霉葡萄糖氧化酶的研究概況

為了提高酶的產量，很多學者對釀酒酵母基因工程菌的培養進行了詳細研究。從1998年-2001年，Kapat等［41-44］連續發表了4篇論文探討產黑曲霉GOD基因工程釀酒酵母培養的問題。在首先發表的論文中研究了不同的補糖（包括葡萄糖和半乳糖）策略對重組釀酒酵母產GOD的影響，恒速流加半乳糖的策略下產酶達到最高，達154U/mL，比分批式操作提高了52％［41］。之后運用恒定pH反饋補料分批式發酵策略使胞外酶活力提高到了199U/mL，比普通分批式發酵提高了1倍多，比非反饋控制的補料分批式發酵（154U/mL）提高了28％［44］。隨后他們的試驗證實了連續補加半乳糖不適合重組黑曲霉GOD發酵：雖然96h后酶活力達到164U/mL，但是會形成過量的乙醇，并且還會造成表達載體的不穩定［43］。2001年發表的論文中，他們雖然證明了攪拌速率對酶產量有直接的作用，但是建立kLa與酶產量之間的關系的工作沒有成功［42］。

綜合上述文獻，有兩點需要引起注意：第一，使用GOD本身的信號肽序列可以取很高的分泌水平，甚至比常用的分泌效率已經很強的強釀酒酵母α-factor信號肽序列更高［34］；第二，不同的釀酒酵母作為表達宿主時表達水平相差很大，De Baetselier等［45］在其論文中也指出，在利用相同的表達載體表達相同的黑曲霉GOD基因時，不同的釀酒酵母菌株表達水平高者和低者可相差百倍。隨著將來對這些現象內在機制的深入研究，必將使得人們對外源蛋白的表達機制的認識得到進一步的深化。

同其他主要表達體系相比，使用釀酒酵母進行表達雖然是較早的方法，但是取得的效果較新興的表達體系相差并不很多［36，46，47］，其原因有待深入探討；釀酒酵母為GRAS生物，重組酶的生物安全性也較好。缺點在于目前大部分采用的均為附加體載體，這種載體的優點是拷貝數高，但是在發酵過程中容易丟失，造成菌種生產性能的不穩定。整合型載體穩定性好，但是目前表達水平還不盡如人意。3.2.3 巴斯德畢赤酵母表達黑曲霉GOD 巴斯德畢赤酵母是一種成熟的真核微生物外源蛋白表達平臺，具有以下特點［48］：生長迅速并培養廉價；作為一種真核生物，具備翻譯后蛋白加工能力，在酵母中合成的蛋白質更有可能正確的加工、折疊與正確的組裝成具有功能的分子。同釀酒酵母和其他酵母相比，畢赤酵母不傾向于發酵糖和其他碳源，而更傾向于利用它們進行有氧呼吸生長，這極大地有利于高細胞培養：因為它只是簡單的把碳源轉化成生物量，不產生大量的有毒的發酵產物，如乙醇。重組蛋白的產量通常同生物量成比例，因此巴斯德畢赤酵母易于進行高密度培養是一個主要的優勢。另外，巴斯德畢赤酵母能夠以甲醇為唯一碳源和能源進行生長，在這種條件下，醇脫氫酶（AOX）和二羥丙酮合酶（DHAS）可以占細胞蛋白的近30％，并且這兩種蛋白的水平的調控主要是在轉錄水平上的，因此使用其啟動子可以驅使外源基因得到較高水平的表達。近年來關于利用巴斯德畢赤酵母表達黑曲霉GOD的主要報道，如表3所示。

表3 巴斯德畢赤酵母表達黑曲霉葡萄糖氧化酶的研究概況

畢赤酵母表達黑曲霉GOD在發酵罐中可以達到很高水平［46］，但在搖瓶中表達水平不高，這是由于畢赤酵母本身的特性所致［48］。在某些情形下，重組酶的特性還有所改善，如周亞鳳［49］報道重組GOD的比活、轉換數kcat值及二級動力學常數 kcat /Km比活明顯地高于商品酶，黃亮［51］報道重組酶最適溫度較黑曲霉GOD提高了8℃。但是，巴斯德畢赤酵母為宿主表達黑曲霉GOD也還存在一些缺點：首先是巴斯德畢赤酵母本身不屬于美國食品藥品管理局（FDA）所認證的GRAS微生物，表達的重組酶存在生物安全性問題，限制了在食品方面的應用；其次，誘導型表達過程中需要甲醇誘導，而甲醇是有毒易燃品，不但給生產人員的安全和消防安全帶來隱患，而且在酶的分離純化過程中帶來額外的麻煩，特別是將GOD用作食品添加劑時。組成型表達可以避免這個問題，但是酶活力很低［52］。因此將巴斯德畢赤酵母表達系統應用于黑曲霉GOD的工業化生產還存在很多問題亟待解決。釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母在表達黑曲霉GOD方面的比較如表4所示。3.2.4 其他表達系統在表達黑曲霉GOD 其他表達系統在黑曲霉GOD表達方面應用的不多。安玉麟等［53］用原核生物大腸桿菌表達了黑曲霉酶GOD，得到的轉化子的總蛋白同抗黑曲霉GOD血清有較強的免疫反應。在真核表達方面，Whittington等［29］通過基因工程手段使不產GOD的構巢曲霉顯著的表達了黑曲霉GOD。Hodgkins等［54］使用多型漢遜酵母表達了黑曲霉GOD，胞外酶活力達到445U/mL（2.25g/mL），胞內酶活為 76U/mL（0.38g/mL），達到了很高的水平。2006年，母敬郁等［55］以瑞氏木霉為宿主進行表達，誘導5d后酶活為25U/mL。2010年，Rocha［56］發表了以馬克斯克魯維酵母表達GOD的結果，當以附加體表達系統表達時，胞外酶活最高為 1552U/g DCW（DCW：Dry Cell Weight）。同年，Dowdells等［57］在土曲霉中表達了黑曲霉GOD，并用轉化子進行葡萄糖糖酸的生產。

表4 表達黑曲霉GOD釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母基因工程菌的比較

3.2.5 黑曲霉GOD基因的改造 定向進化已經成為獲得高效生物催化劑的重要手段，其主要原理是向蛋白編碼基因中引入隨機突變并利用高通量篩選手段篩選蛋白突變體，進而選擇出其對應的編碼序列以進行下一步的突變與篩選，不斷的重復這一過程使得有益突變得到積累。定向進化的過程由幾個步驟循環進行：產生隨機的基因文庫；在適宜的宿主中表達；篩選突變酶的文庫，尋求具有感興趣的性質的突變體［58］。手段有 DNA shuffling［59］，易錯PCR［60］和交錯延伸過程［61］等。

劉丹等［62］通過兩輪易錯PCR，從3000多個突變子中得到3個酶活提高的突變株，成功使比活力提高到原來的3-4倍。Prodanovic等［63］采用超高通量篩選從含有105個突變體的107個細胞中得到催化活力提高2倍的突變體K150R。Yu等［64］利用定向進化的手段得到了更適用于酶電極的突變體B11-Gox。Holland等［65］通過對黑曲霉GOD基因進行飽和突變發現，當132位的蘇氨酸突變成絲氨酸時，特異性常數kcat/Km從8.39mmol/L/S變為23.8mmol/L/s，同時對底物親和力僅僅降低了3％。對于GOD的定向進化還處于起步階段，發展潛力很大。

4 展望

4.1 深入研究宿主蛋白表達分泌機制，通過基因工程手段改良現有表達系統

不同的表達系統表達黑曲霉GOD的水平的差別相當大［31，36，47，54，55］，并且用相同的載體轉化同一種生物的不同菌株，得到的外源蛋白的表達水平也有相當大的差別［45］，宿主細胞蛋白表達與分泌機制的不同是導致該結果的重要的原因。目前，一些主要的外源蛋白表達宿主均已經完成了基因組測序［66-69］，對這些微生物的蛋白表達、加工、分泌機制的研究也在進一步的深入。通過對微生物原有分泌表達機器的改造，可以獲得更適用于蛋白生產的菌株。因此，需要從基因組水平乃至蛋白質組水平對外源蛋白分泌表達機制深入的進行研究，并以分子生物學操作獲得更合適的宿主菌株，使現在發展較成熟的表達系統得到進一步的發展。

4.2 開發新型表達載體與宿主

開發新型的表達載體和宿主也是解決外源蛋白表達水平不高的有效途徑。為了解決附加體載體的不穩定性和整合型載體拷貝數少的問題，Lopes等［70，71］開發了rDNA整合型載體，每個細胞中整合的拷貝數可達100-200個，并且具有相當的穩定性。

4.3 蛋白質定向進化

通過高通量篩選突變體，積累有益突變，可以得到比活力更高的酶，或者具有其他優良特性的酶，加強酶的耐熱性、穩定性等。

4.4 過程優化

包括誘導劑［43］、過程條件［42］、培養基成分［33］等。通過這些可以增加酶產量，促進酶的分泌［32］，降低工程菌自身的蛋白酶活性［72］等。另外，反應器培養時表達水平有可能與搖瓶不同，因此在放大過程中也需要進一步的優化條件［72］。

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