蝦蟹類卵巢發育調節機制研究進展

王曉偉 張子平 王藝磊 賈錫偉 林鵬

蝦蟹類是重要的水產養殖和捕撈對象，具有很高的經濟價值。蝦蟹生殖生物學研究對其養殖產業的發展非常重要，通過調控蝦蟹內分泌系統提高生殖發育速度、縮短成熟時間，將可促進蝦蟹養殖產量的提高。去除眼柄（eyestalk ablation，ESA）是刺激蝦蟹類性腺成熟和排卵的常用方法，普遍認為這是因為去除了眼柄中的性腺抑制激素（gonad inhibitinghormones，GIH），但ESA會導致卵子質量下降，孵化率降低等。在過去的30年，一些嘗試通過調控內分泌系統而非ESA的方式來誘導生殖。如使用GIH抗體、神經遞質進行調控；通過雙鏈RNA干擾（dsRNAi）降低GIH轉錄；通過溫度、鹽度、光周期等環境因子改變激素水平等［1］進而調控生殖細胞的形成和卵黃蛋白的合成等。

1 CHH家族在生殖中的作用

CHH家族是竇腺（sinus gland，SG）中最豐富的一類肽激素［2］。該家族包括甲殼動物高血糖激素（crustaceanhyperglycemichormone，CHH）、蛻皮抑制 激 素（molt-inhibitinghormone，MIH）、 性 腺 抑制激素（vitellogenesis/gonad-inhibitinghormone，VIH/GIH）、大顎器官（mandibular organ，MO）抑制激素（MOIH）。這些CHH家族神經肽根據成熟肽及其前體的初級結構可分為Ⅰ型和Ⅱ型兩種，Ⅰ型神經肽前體由信號肽序列、CHH前體相關序列、堿性氨基酸加工位點和成熟肽部分組成，成熟肽一般由72-73個氨基酸殘基組成；Ⅱ型神經肽只有信號肽和成熟肽序列兩部分組成，其成熟肽部分由74-83個氨基酸殘基組成［3］。這些激素成熟肽的分子量約為7-9kD，氨基酸序列相似，均有6個保守的半胱氨酸殘基，形成3個二硫鍵［4］。兩種類型神經肽的最大區別在于Ⅱ型神經肽的成熟肽部分第12個氨基酸為甘氨酸［3］。研究表明，VIH/GIH抑制性腺的發育在調控蝦蟹類甲殼動物性腺發育過程中起關鍵作用；CHH、MIH和MOIH在性腺發育中的作用也越來越受到重視。

1.1 VIH

VIH抑制蝦蟹類卵巢發育。在鋸齒長臂蝦（Palaemon serratus）中去除眼柄會引起卵黃物質提前積累和卵巢體積快速增加。Pervaiz 等［5］，Alikunhi［6］和Arnstein［7］分別在對沼蝦屬Macrobrachium dayanum、斑節對蝦（Penaeusmonodon）和中國對蝦（Penaeus orientalis）的去除眼柄的研究中也得到類似結果，這顯然是由于去除眼柄后解除了GIH/VIH對性腺發育的抑制。一些研究進一步報道在蝦蟹中GIH的靶器官是卵巢和肝胰腺［8］。與成熟斑節對蝦VIH序列相關的dsRNA能夠使體外培養的斑節對蝦眼柄神經節、腹神經索和斑節對蝦親體的VIH轉錄水平降低；敲除斑節對蝦的VIH其卵巢的卵黃蛋白原（vitellogenin，Vtg）轉錄水平顯著上升，說明了VIH對Vtg基因表達有抑制作用［8］。最新的研究表明，MEK1/2抑制劑U0126可以誘導斑節對蝦卵巢成熟，且推測ERK1/2抑制眼柄XO-SG中VIH的表達［9］。Rotllant等［10］用免疫組織化學和原位雜交的方法對歐洲龍蝦（Homarus gammarus）幼體和成體中VIH的比較研究發現，幼體中VIH的濃度遠高于成體，這說明幼體期VIH高表達抑制卵巢的發育有利于機體的生長，成體VIH低表達有利于卵巢的發育，在發育期之前VIH可能對性腺發育有抑制作用。De Kleijn等［11］研究了美洲龍蝦（Homarus americanus）VIH在生殖周期過程中的表達、儲藏和釋放機制發現，VIH在X器官表達，Ⅰ型VIH在竇陷中出現，且只在未成熟期表達。與此相反，VIH在未成熟和卵黃發生前期的血淋巴均有高水平表達。由此推測，VIH可能抑制卵巢中卵黃生成的啟動。Wongsawang等［12］報道眼柄提取物含有性腺抑制激素和刺激性腺的多肽，如VIH和GSH（gonad stimulatehormone，GSH）。當VIH和蛻皮類固醇濃度低，性腺刺激因子（gonad stimulate factor，GSF）和甲基法尼酯（methyl farnesoate，MF）濃度高時，可以啟動甲殼動物的生殖［13，14］。這些研究結果均表明眼柄神經肽VIH抑制性腺發育。

1.2 MIH

MIH的主要功能是抑制Y器官合成蛻皮激素，延長蛻皮周期，而在蝦蟹類中關于MIH調控生殖的報道較少［15］。目前，已經在黃道蟹（Cancer pagurus）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）、紅鰲螯蝦（Cherax quadricarinatus）、刀額新對蝦（Metapenaeus ensis）等中獲得了MIH全長序列。已有證據表明MIH促進性腺的發育。如Tiu等［16］對雌性刀額新對蝦注射重組MIH蛋白后發現，肝胰腺中卵黃蛋白原基因的表達水平上升，并且相應的在這些雌蝦的血淋巴和卵巢中檢測到具有類似卵黃蛋白原免疫原性的蛋白；而在注射MIH-B dsRNA后，這些雌蝦胸神經節和卵巢中MIH水平下降，同時肝胰腺和卵巢中卵黃蛋白原表達量下降。在刀額新對蝦中MIH的mRNA轉錄水平在卵黃發生前期低下，在到成熟晚期的過程中表達量不斷上升［17］。MIH與特異的受體結合后，可能以cAMP為第二信使將細胞外信號傳遞到細胞內［18］。此外，MIH在肝胰腺上結合位點的數量隨卵巢發育發生變化，Ⅲ期比Ⅰ期和Ⅱ期高2倍［18］。這些結果表明MIH是甲殼動物蛻皮和繁殖的關鍵調節因子，它可以同時參與抑制蛻皮和誘導卵巢成熟。

1.3 MOIH

MOIH是由XO-SG復合體分泌的神經肽，能夠間接的抑制卵黃的發生。MOIH抑制甲殼動物大顎器分泌MF，而MF促進動物卵黃發生，是一種重要的甲殼動物的性腺刺激激素。因此，MOIH通過抑制大額器官MF的分泌而間接抑制卵黃發生。有一些研究結果支持這一觀點，Borst等［19］發現利用反向高效液相色譜法（reversed-phasehigh performance liquid chromatography，RP-HPLC）從黃道蟹眼柄SG提取物中分離到MOIH-1和MOIH-2，且證明它們直接作用于MO，抑制MF的生物合成，降低法尼酸甲基轉移酶（farnesoic acid O-methyl transferase，FAO-MeT）活性；Nagaraju等［20］在淡水蟹Oziotelphusa senex senex中鑒定出兩種具有MOIH活性的多肽，具有抑制MO合成MF的活性。Borst等［19］研究黃道蟹的得出同樣的結論。他們研究多種影響信號通路的物質發現，cAMP在MOIH抑制MF合成的信號傳導過程中起重要作用。為進一步闡明MOIH對性腺發育的調控機制，許多學者對MF的功能也作了大量研究。MF是昆蟲類保幼激素Ⅲ前體類似物，已證實它與后者有類似功能。對普通濱蟹（Carcinusmaenas）和蜘蛛蟹（Libinia emarginata）大顎器官的組織學研究表明，其在卵巢成熟時有更高的活性。離體試驗證明MF與普通濱蟹、蜘蛛蟹及大西洋砂招潮蟹（Uca pugilator）的卵巢發育有關。克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）和淡水蟹O.senex senex中大顎器合成MF的速率隨性腺發育而發生顯著變化［21］。在一些甲殼動物中注射MF可以提高血淋巴中Vtg的濃度，刺激卵巢成熟發育［14，22-24］。體外研究顯示MF刺激卵母細胞增長，提高肝胰腺與卵巢Vtg的mRNA水平。這些結果表明MOIH抑制MO合成MF，MF直接作用于肝胰腺和卵巢，從而調控性腺的發育（圖1）。

圖1 蝦蟹卵巢發育調控模式圖

1.4 CHH

在普通濱蟹和利莫斯螯蝦（Orconectes limosus）中的受體結合試驗表明，CHH可能有不同的靶標，并且有可能促進生殖。在藍蟹（Callinectes sapidus）卵巢發育早期CHH能刺激卵黃發生［25］。De Kleijn等［8］研究美洲海螯蝦（Amrica langostino）CHH在生殖周期的表達發現，CHH-A在卵黃生成前有高表達，CHH-B隨性腺卵巢的成熟表達量不斷增加，CHH總量（CHH-A和CHH-B）在成熟的過程中有明顯升高。由此認為CHH-A和CHH-B有參與啟動卵黃生成作用，CHH-B負責刺激卵母細胞成熟。Webster［26］報道在包括三葉真蟹（Carcinusmaenus）卵母細胞膜在內的多種組織中有CHH受體存在，說明CHH在這些組織中可能具有不同的功能。

2 GSFs在蝦蟹類生殖中的作用

目前對GSF的研究還較少，ESA的效應與胸神經節或腦的移植試驗表明存在GSFs，但這些物質是不是多肽尚不清楚，需要對GSFs的特性進一步研究。匙指蝦科的Paratya compressa和哈氏仿對蝦（Parapenaeopsishardwickii）的腦和胸神經節提取物在體內和體外都可以促進卵巢的生長，但是在P.compressa中腦的提取物比胸神經節更有效。腦和胸神經節提取物可以誘導P.compressa卵巢的成熟和次級卵母細胞的發育。在大西洋砂招潮蟹中，GSF隨著每年的生殖周期而變化。Yano等［27］報道美洲龍蝦的胸神經節移植入無生殖能力的凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）可引起卵巢的成熟。注射腦和胸神經節提取物及在體外的孵育試驗表明胸神經節提取物能夠促進卵黃生成，這些結果說明GSF的作用可能沒有物種特異性。

3 類固醇激素在蝦蟹類甲殼動物生殖中的作用

3.1 蛻皮激素

蛻皮激素的功能除參與蛻皮外，在調節蝦蟹類卵黃生成、卵巢成熟和蛋白合成中也起著重要作用［12，28，29］。已發現蛻皮激素在長縫擬對蝦（Parapenaeus fissures）、美洲龍蝦、鋸齒長臂蝦、歐洲龍蝦、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、蜘蛛蟹和斑節對蝦卵巢及卵子中存在。Lachaise等［30］發現，在普通濱蟹卵巢發育過程中卵巢蛻皮激素水平升高。在Acanthonyx lunulatus，日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）［31］和羅氏沼蝦中觀察到卵黃發生與血淋巴蛻皮激素濃度的正相關關系。20-羥基蛻皮激素（20-hydroxyecdysone）在體外明顯刺激斑節對蝦Vg1基因在卵巢和肝胰腺的表達［32］。然而，Young等發現在斑節對蝦的卵黃發生過程中血淋巴蛻皮激素水平降低。鋸緣青蟹（Scylla serrata）卵巢和血淋巴中的固醇類激素水平在卵黃發生初期上升［33］。為進一步了解蝦蟹類的生殖調節機制，蛻皮激素在生殖方面的作用還需要進一步的研究。

3.2 脊椎動物型類固醇激素

甲殼動物性腺存在與脊椎動物相同的性類固醇激素，而且甲殼動物酶系統也具有合成脊椎動物型類固醇的能力［29，34，35］。Fairs 等［36］研究了斑節對蝦卵黃發生過程中的類固醇濃度的變化發現，在卵黃生成階段雌激素濃度高，這說明雌激素可能具有刺激卵黃發生的作用。黃體酮和雌二醇是脊椎動物型類固醇，在斑節對蝦和短趾和尚蟹（Mictyris brevidactylus）中血淋巴Vtg水平與黃體酮成正相關關系。在哈氏仿對蝦中注射黃體酮可以誘導卵巢的發育。與此相反，在日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）卵巢成熟與血淋巴類固醇激素水平之間存在負相關關系［31］。在鋸緣青蟹卵黃發生的不同時期，卵巢和血淋巴中的黃體酮發生波動［33］。黃體酮和雌二醇明顯刺激刀額新對蝦的肝胰腺和卵巢組織中Vg1基因的表達［32］。向日本囊對蝦注射17α-羥孕酮可促進卵巢的生長和卵黃生成作用。17β-雌二醇可以刺激Cherax albidus的卵黃生成［37］。注射 17α-羥孕酮可誘導O.senex senex［38］卵巢成熟。在脊椎動物中，類固醇激素要發揮生理作用必須與核受體相結合。

4 神經遞質在生殖中的作用

神經遞質在蝦蟹類生殖中的作用越來越受到重視，一些蝦蟹類神經遞質功能的研究已取得進展。Beltz［39］發現生物氨類物質5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和章魚氨（octopamine，OA）在控制美洲海螯蝦的交配行為中起關鍵作用（圖1）。Kulkarni的研究表明5-HT刺激克氏原螯蝦的卵母細胞成熟。Tinikul等［40］應用高效液相色譜結合電化學檢測技術對羅氏沼蝦卵巢發育各時期中樞神經系統和卵巢中5-HT和多巴胺（dopamine，DA）濃度進行測定發現，腦和胸神經節中5-HT隨卵巢發育逐漸升高，且在第Ⅳ期達到最大，而腦和胸神經節中DA的濃度在卵巢發育第Ⅱ期達到最高，隨后降低；且注射5-HT可使Ⅳ期的血淋巴中Vtg含量顯著增加，而注射DA則效果相反。還有一些研究發現，5-HT和DA在利莫斯螯蝦、克式原螯蝦（Procambarus clarkii）和羅氏沼蝦的中樞神經系統廣泛分布且隨卵巢發育各時期發生變化［41］。生物氨在一些蝦蟹類動物中作為神經遞質參與神經激素的釋放［42］。如在招潮蟹和克式原螯蝦中注射5-HT激活了胸神經節釋放GSF。5-HT注射克式原螯蝦促進了14C標記的亮氨酸進入卵巢蛋白。進一步研究發現DA在雌性克式原螯蝦中抑制5-HT促進性腺發育的作用，而OA是否促進美洲龍蝦卵巢生長取決于劑量大小。在凡納濱對蝦［43］中注射5-HT可以誘導卵巢的發育，但比單側ESA效率低。Alfaro等［44］用5-HT和DA拮抗物螺旋哌丁苯（spiperone）處理凡納濱對蝦和南美藍對蝦（Litopenaeus stylirostris），促進了卵巢的發育和排卵。同時注射5-HT與螺旋哌丁苯和單獨注射螺旋哌丁苯都能刺激羅氏沼蝦卵巢成熟和胚胎發育，使卵巢指數和卵母細胞直徑增加［45］。也有人報道用螺旋哌丁苯處理紅螯螯蝦（Aegla platensis）可以刺激卵巢的成熟并且使產卵量升高［46］。Cahansky等［46］也報道，含有螺旋哌丁苯的食物可以使魔蝎蝦（Aegla platensis）的性腺指數（gonadosomatic index，GSI）升高。在卵黃發生前期注射螺旋哌丁苯引起克式原螯蝦GSI增加［47］。螺旋哌丁苯也可以引起Aegla uruguayana schmitt卵巢和肝胰腺中脂質和膽固醇的增加［48］，他們發現高性腺指數伴隨著卵巢和/或肝胰腺的高脂質含量，這說明生殖過程需要大量能量。也有研究顯示，5-HT注射羅氏沼蝦引起血淋巴中 Vg含量顯著上升［49］。Meeratana等［50］關于5-HT對羅氏沼蝦卵巢發育影響的研究表明，5-HT間接的誘導卵巢發育和卵母細胞成熟。可見，5-HT和DA在蝦蟹類性腺發育和排卵的拮抗調控過程中起著關鍵的作用（圖1）。

5 環境因子對生殖的影響

在生物進化的過程中，甲殼動物形成了較為完善的生殖調控系統，生殖相關激素水平會隨外界環境變化作出相應改變，使甲殼動物在最佳的環境條件下生殖。環境的變化因素如鹽度、光照、溫度在調節甲殼動物生理（包括生殖、蛻皮、攝食、行為和形態變化等）中起重要作用［1］（圖1）。Nagaraju和Borst［24］在11℃和18℃時將普通濱蟹轉移到稀釋的海水，MF上升了近100％。已有與其結果一致的報道。隨著水的鹽度稀釋到5 ppt，青蟹血淋巴中MF水平比海水等滲溶液中的青蟹增加5-10倍［51］。高溫（32℃）、缺氧（0.25 ppm O2）和降低鹽度都可以引起普通濱蟹［52］血淋巴中MF的顯著上升。而將廣鹽性的藍蟹暴露在低鹽度（15 ppt）的海水中，血淋巴MF的水平不會上升［53］；在11℃時用低鹽度的水處理的普通濱蟹也觀察到類似的結果［24］。Akta等［54］分別研究了在桃紅對蝦（Penaeus duorarum）和短溝對蝦的溫度變化對卵巢發育和排卵的影響發現，水溫在20-28℃的周期（10d）波動成功誘導卵巢成熟，排卵次數翻倍。合適的環境因子（如水溫、溫度和鹽度等）與神經內分泌的相互協調是保證蝦蟹類每年生殖和蛻皮按一定的時間順序進行的關鍵。已有報道，在一些甲殼動物中光周期是生殖的強誘導劑。Kulkami等［55］利用反向高效液相色譜法發現，光照可以引起克氏原螯蝦（Procambarus clarkia）中樞神經系統中5-HT含量顯著升高；而持續黑暗使其含量降低。在實驗室條件下，給美洲龍蝦長的光照周期可以顯著促進卵巢成熟和Vtg的合成。

6 結語

為進一步了解蝦蟹類性腺發育調控的機制，需要綜合利用細胞和分子甚至是個體水平的研究手段。本實驗室構建了多個擬穴青蟹性腺EST文庫，并對性腺和調控性腺發育的主要器官眼柄和肝胰腺進行了轉錄組測序。發現了多條信號通路在性腺發育中的作用。目前正在利用定量PCR、誘導表達、細胞培養、RNAi等多種技術對已知基因功能進行分析，努力發掘生殖調控相關的未知基因。這將為豐富蝦蟹類生殖調控的分子機制提供參考資料。生物的性腺發育是個復雜而有序的生物學過程，隨著研究技術手段不斷的提高，相信與性腺發育和卵子發生相關的基因將陸續被發現，性腺發育過程中的調控機制也將逐步被人們所認識。

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