半持久性病毒的介體傳播機制研究進展

田曉 李玲娣 劉金香

病毒介體有昆蟲、線蟲、螨和真菌等，絕大多數病毒依賴于昆蟲傳播。傳毒昆蟲主要集中在同翅目，其中蚜蟲傳播植物病毒的能力居病毒媒介昆蟲的首位，是最主要的傳毒介體，而葉蟬和飛虱是僅次于蚜蟲的最重要的昆蟲介體［1］。介體以非持久性方式（nonpersistent transmission）、半持久性方式（semipersistent transmission）和持久性方式（persistent transmission）傳播植物病毒，持久性傳播又分為增殖型傳播（propagative transmission）和非增殖型傳播（nonpropagative transmission）兩種［2，3］。在非持久性傳播中，介體利用口針連續刺穿植物表皮細胞的細胞膜獲毒，故介體獲毒時間短暫；在半持久性傳播中，介體獲毒位點一般在韌皮部，需長時間穿刺，故介體獲毒時間在幾分鐘到數小時之間；而在持久循環型傳播和持久增值型傳播中，介體獲毒時間長達幾小時到幾天。植物病毒與傳播介體的關系，詳見表1。最近分子生物學、免疫學和細胞生物學技術的應用，促進了植物病毒介體傳播機制的研究。國內外已有對非持久性和持久性傳播機制的概述，但對于半持久性傳播機制的研究比較少，目前國內尚未見這方面的綜述報道。本文就半持久性病毒傳播機制研究進展作一概述。

表1 植物病毒與其傳播介體的關系

1 半持久性病毒的特性

目前發現的半持久性病毒的種類不多，主要屬于長線形病毒科（Closteroviridae）、花椰菜花葉病毒科（Caulimoviridae）、曲線病毒科（Flexiviridae）和伴生病毒科（Sequiviridae）等（表2），這些科的病毒粒體形態呈桿菌狀、線狀或等軸球狀，其基因組有單分體和二分體的DNA和RNA。蚜蟲以半持久性方式傳播花椰菜花葉病毒（Cauliflowermosaic virus，CaMV）、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）和甜菜黃化病毒（beet yellows virus，BYV）等；葉蟬以半持久性方式傳播玉米褪綠矮縮病毒（Maize chlorotic dwarf virus，MCDV）、水稻東格魯球狀病毒（Rice tungro spherical virus，RTSV）和水稻東格魯桿狀病毒（Rice tungro badnavirus，RTBV）等；煙粉虱以半持久性方式傳播萵苣侵染性黃化病毒（Lettuce infectious yellows crinivirus，LIYV）和長線形病毒屬的一些病毒。

2 研究方法

目前研究傳播機制的方法主要有免疫印跡和血清學中和試驗等，隨著各類學科的全面發展，各種技術不斷成熟，同時也出現了許多新技術。

2.1 免疫印跡法（immunoblotting）

免疫印跡法是檢測蛋白質特性、表達與分布最常用的方法。Tian等［5］應用免疫印跡法分析LIYV病毒粒子，在病毒粒子的抽提液中檢測到了外殼蛋 白（capsid protein，CP）、 小 外 殼 蛋 白（minor capsid protein，CPm）、59kD蛋 白（59-kD apparentmolecularmass protein，P59）和熱休克HSP70同源蛋 白（heat shock protein70homologue，HSP70h）。Satyanarayana等［6］合成CPm的多克隆抗體并進行免疫印跡分析證實CTV CPm僅由突變體b（在CTV 5'非翻譯區第一個莖環結構的頂端）和突變體e（在CTV 5'非翻譯區第二個莖環結構的底部）構成。Drucker等［7］將融合表達的P2固定在樹脂上，研究CaMV粒子或P3與P2的相互結合發現，只有CaMV和P3同時存在時，病毒與P2才可以相結合，并且CaMV、P3和P2的復合體可以經蚜蟲傳播。Peremyslov等［8］在提純病毒 BYV時發現，CP在梯度離心的最上層，且HSP70h、64kD蛋白（64-kD protein，P64）、20kD 蛋白（20-kD protein，P20）和CPm在同一密度梯度最亮，并通過與點突變結合分析發現BYV P20雖是病毒粒子組裝必需的蛋白但對其他蛋白與病毒粒子的結合不是必需的。Druka等［9］為了確定從健康植株及感染RTSV植株中萃取的蛋白是否已被純化，利用免疫印跡法進行分析發現，麥芽糖結合蛋白（maltose-binding protein，MBP）抗體與這些蛋白均無交叉反應，這說明純化的蛋白中已不含MBP。

表2 半持久性病毒的特性

2.2 血清學侵染性中和分析（serological infectivity neutralization analyses）

血清學侵染性中和分析是根據抗體能否影響病毒的侵染性而建立的免疫學試驗。Tian等［5］發現，LIYV CPm抗血清幾乎完全阻滯了LIYV病毒粒子的傳播，推測CPm在LIYV的粉虱傳播中有至關重要的作用。Hibino等［10］以薄膜飼喂法為基礎利用血清學試驗探究與水稻東格魯病發生相關的病毒。

2.3 免疫金標記和電鏡技術（immunogold labeling and transmission electronmicroscopy，IGL-TEM）

結合膠體金探針與病原抗原蛋白達到將病原定位于細胞的目的，并且靈敏度高、操作步驟簡便、檢測快速。Satyanarayana等［6］通過標記 CTV的CPm抗體發現，CPm包裹病毒5'端RNA。Khelifa等［11］在低密度病毒內含體（electron-lucent viral inclusion bodies，elIBs）中檢測到CaMV P2和P3，而在高密度病毒內含體（electron-dense viral inclusion bodies，edIBs）中只檢測到CaMV P3，推測edIBs中可能有P3和病毒粒子復合體，elIBs可能有P2、P3及病毒粒子復合體。

2.4 免疫熒光定位（Immunofluorescence technique）

免疫熒光技術特異性強、敏感性高、速度快。Chen等［12］利用免疫熒光定位技術發現，LIYV病毒粒子特異地滯留在煙粉虱的前腸或食竇，且CPm與LIYV病毒粒子的傳播密切相關。Martinière等［13］用熒光素標記的二抗免疫確定CaMV 的P2和P3在感病植株的部位發現，P2可以和細胞微管結合，在P2存在的情況下，P3也可以與細胞微管結合，進一步表明病毒與寄主細胞微管的相互作用有助于病毒的介體傳播。

2.5 X射線晶體學（X-ray crystallography）

X射線晶體學是將X射線與晶體學聯系起來研究各類晶體結構，特別是蛋白質晶體結構。Francois等［14］利用X射線晶體學分析CaMV病毒粒子P3的結構，游離的P3 N端是4個平行的無規則卷曲的四聚體得知未配對P3 N末端是四聚物平行螺旋，并與獨特的組織通過二硫鍵形成反向右手超螺旋。

3 傳毒機制

3.1 外殼機制

外殼蛋白參與介體傳播有兩種方式，一種是只有外殼蛋白決定介體的傳播；另一種是介體的傳播需要病毒編碼的蛋白的參與，外殼蛋白與輔助蛋白共同介導介體傳播。只有外殼蛋白決定介體傳播的最初證據來自于在沒有其他蛋白質或因子的情況下提純的病毒可以在人工飼喂系統上傳播，純化的LIYV粒體能夠由煙粉虱在體外獲得后以半持久性方式傳播，說明LIYV通過外殼機制傳播。LIYV是目前發現的第一個不需要輔助成分就可以通過半持久性方式傳播的病毒［15］。

Tian等［5］應用免疫膠體金標記分析LIYV病毒粒子發現，CP覆蓋LIYV基因組的95％，CPm僅出現在病毒粒子的一個末端，覆蓋基因組的5％。Tian等［5］發現CPm的抗血清能很大程度地降低傳毒率甚至無法傳毒。為了進一步研究LIYV傳播的決定因素，Stewart等［16］構建了LIYV突變體發現，CPm是LIYV煙粉虱傳播的必需成分。

3.2 輔助機制

3.2.1 輔助因子 輔助機制研究地比較清楚的半持久性病毒是CaMV。CaMV的蚜傳非常復雜，其蚜傳需要的3種成分，包括P2、P3和P4。P2 是CaMV編碼的18-kD非結構蛋白，被稱為輔助蛋白，P2的N端與蚜蟲口針結合；P3是CaMV編碼的15-kD蛋白，錨定在CaMV病毒粒子上；P4是CaMV主要外殼蛋白［7］。史曉斌等和 Uzest等［17，18］通過綠色熒光蛋白標記發現P2 的滯留位于蚜蟲口針末端。體外覆蓋試驗及活性鑒定表明P3與P2的C端結合，P3連接P4［19，20］，在某種程度上P3在 P2和 P4間起到橋的作用，CaMV通過P2連接到蚜蟲口針上。Moreno等［21］發現P2 N端的第六位氨基酸是CaMV蚜傳的決定因素。CaMV感染植物時，能誘導形成內含體，內含體中有蚜蟲傳毒所需的病毒粒子成分——P2、P3及病毒顆粒。此內含體又被稱為傳播體（transmission body，TB），對蚜蟲傳毒有重要作用。根據P3的N端特性推斷，P3構象變化起到分子開關的作用。P3處于還原態后，能結合內含體的P2或其他成分，若P3處于氧化態，則結合位點被封閉，TB會立刻分解，它的組成成分會分散，從而被蚜蟲獲得，并推測氧化還原態的改變與蚜蟲穿刺植物細胞引起的活性氧相關［14，22］。

MCDV也是通過輔助成分以半持久性方式經葉蟬傳播，但對其傳播機制的研究很少。Hunt等［23］推測一種類似輔助成分的蛋白存在于MCDV的傳播中，但具體成分還未被鑒定。2004年，Rym等［24］分別抽提在健康植株和感染MCDV-S的植株上取食的葉蟬，并利用MCDV-T、R78、R37和R69的抗體與之進行免疫印跡，只有R78與類似P25的25kD蛋白反應。但在感染MCDV-S的植物抽提液中沒有檢測到25kD蛋白（25-kD protein，P25），只檢測到35kD蛋白（35-kD protein，P35）。但帶毒葉蟬體內P35的含量沒有P25豐富，據此推斷P25在葉蟬中不斷地累積，而且葉蟬傳毒48h后，體內的P25快速消失。推測P25可能是MCDV的輔助成分。

3.2.2 輔助病毒 水稻東格魯病由分類學上不相關的兩種病毒引發，即 RTBV 和 RTSV［25］。Hibino［26］提出水稻同時感染RTBV和RTSV才能表現癥狀，若只感染RTSV只會表現輕微萎縮。Hibino［27］發現RTBV只有在RTSV存在時才能傳播。葉蟬取食感染RTSV或RTBV的植株后傳毒，只能在受毒植株中檢測到RTSV而不能檢測到RTBV。若葉蟬取食感染RTSV的植株再取食感染RTBV的植株后傳毒，則健康植株染??；但若葉蟬先感染RTBV再感染RTSV后傳毒給健康植株，RTBV仍不能被傳播。然這說明RTSV是RTBV的輔助病毒，也為RTBV傳播機制的研究提供了有用信息。

峨參黃化病毒（Anthriscus yellows virus，AYV）和歐防風黃點病毒（Parsnip yellow fleck virus，PYFV）均以半持久性方式經蚜蟲傳播［20］。Murant等［28］在蚜蟲前腸中發現PYFV及AYV病毒粒子。蚜蟲取食感染PYFV或AYV的植株后，在蚜蟲體內只檢測到AYV而沒有檢測到PYFV；蚜蟲先取食感染AYV的植株再應用膜飼喂法人為飼喂蚜蟲PYFV病毒粒子，則在蚜蟲體內同時檢測到AYV和PYFV；但若蚜蟲先取食健康植株再取食PYFV病毒粒子，則在蚜蟲體內檢測不到PYFV。這是因為感染了AYV的植物可能存在某種輔助成分，這種輔助成分在PYFV的蚜傳中起到關鍵作用，這表明AYV是PYFV的輔助病毒。

4 展望

侵染植物的病毒的復雜多樣使得介體傳播機制各異，目前研究較為深入的是輔助機制和外殼機制。病毒的外殼蛋白參與非持久性黃瓜花葉病毒（cucumbermosaic virus，CMV）和持久性雙生病毒科（Geminiviridae）等病毒的傳播［29-31］，非持久性馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）病毒的介體傳播需要輔助蛋白（helper component proteinase，HC-Pro）的參與，馬鈴薯Y病毒屬病毒CP與HC-Pro相互作用［32-34］。除這兩種機制外，其他的傳播機制尚不清楚。

半持久性病毒的傳播特性介于非持久性病毒和持久性病毒之間，對于其傳播機制的研究相對較少，只有CaMV和LIYV的傳播機制研究較深入。很多半持久性病毒的傳播機制并不清楚，如長線形屬病毒CTV和BYV。近年來，學者們應用分子生物學及實時熒光定量PCR（Real-time PCR），對蚜蟲體內柑桔衰退病毒進行了定性定量測定［35］。雖然對蚜蟲傳播CTV和BYV的分子特征、傳毒特性、傳毒率及影響傳毒率的因素等方面進行了研究［36，37］，但對橘蚜傳播機制的研究一直沒有深入進展。Albiach-Martí等［38］通過分析發現，蚜蟲會選擇性傳播CTV分離株的基因組RNA（genomic RNA，gRNA）變異體及缺陷型 RNA（defective RNA，D-RNA）。Herron等［39］發現CTV的P20蛋白（20-kD protein，P20）抗體可以極大地提高褐色桔蚜傳播T66IH-3分離株的能力，但大外殼蛋白P25（25-kD protein，P25）、P20蛋白和小外殼蛋白P27（27-kD protein，P27）抗體對褐色桔蚜在體外傳播CTV3800和T66aH分離株的能力沒有明顯影響。Barzegar等［40］分析CTV的非蚜傳及蚜傳分離株的P27發現，第14、238和239位的氨基酸被帶不同電荷和極性的新氨基酸替代，氨基酸的替換可能影響了蚜傳效率。He等［41］發現，與BYV 21kD蛋白（21-kD protein，P21）的抗血清相比，BYV 24kD蛋白（24-kD protein，P24）和CP的抗血清抑制了蚜蟲對BYV的傳播，這表明P24和CP可能參與BYV的蚜傳。

熒光標記及血清學試驗有助于半持久性病毒傳播機制的研究。根據不同的傳播機制，制定行之有效的策略來阻斷昆蟲介體對植物病毒的傳播。除此之外，病毒、介體和寄主三者相互作用的深入研究，對于病毒的起源與進化和病毒的流行都具有重要的理論和實際意義。

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