梔子ERF基因的克隆及其在果實成熟過程中的表達

高藍 盧靜雯

植物激素通過調節有關基因的表達來調控植物的生長發育和植株對逆境脅迫的應答反應。其中乙烯可以調控植物的生長發育。如花的發育［1］，果實的成熟過程［2］，以及對病源侵染［3，4］、低氧［5］、低溫及干旱等逆境脅迫的應答反應［6］。在一些植物中，已知被植物激素乙烯調節的相關基因含有順式作用元件GCC盒（AGCCGCC序列）［7］。乙烯反應元件因子（ERF）可以辨認結合GCC盒［8］，是乙烯信號傳導中涉及的一類轉錄因子，已在多種植物中被分離鑒定。如煙草中的NtERF［9］、擬南芥的AtERF［10］、番茄的 leERF 和 Pti［3，11］、矮牽牛（Petuniahybrida）的 PhERF［1］、水稻的 OsERF［12］和大豆的GmEREBP1［13］等。ERF轉錄因子家族都含有一個保守的由60個左右氨基酸組成的結構域（ERF結構域），與擬南芥中的蛋白APETALA2的AP2結構域相似［14］，是AP2/ERF轉錄因子家族中的ERF亞類，與DNA以單體的形式結合。ERF結構域含有3個反平行的β-折疊和一個α-螺旋結構［15］，其中這3個β-折疊結構在識別順式作用元件的過程中具有重要作用。全基因組分析表明，擬南芥有122個ERF蛋白基因，水稻有139個ERF蛋白基因［12］。對各種植物的ERF的功能和表達研究則相對不多，如在擬南芥中只有少數ERF蛋白已經確認參與了對脅迫或對乙烯的應答反應［10，16］。在番茄中，已知Pto蛋白激酶是對丁香假單胞桿菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv.Tomato）的抗性蛋白，Pti4、Pti5和Pti6蛋白可結合于Pto蛋白激酶基因的順式作用元件，促進該激酶的表達［3］。蘋果的MdERF3，MdERF4，MdERF5和MdERF6因子在灰霉病菌（Botrytis cinerea）感染時表達增加，并可受乙烯的誘導［4］，瞬間在煙草中表達MdERF3可增加含GCC盒的幾丁質酶的表達。在番茄中的LeERF1與果實的成熟相關，過表達ERF可增進番茄果實的軟化和成熟［2］。

ERF類轉錄因子參與植物的多種生理過程和生長發育的調節，對于相關基因的分離及其表達和功能的研究有重要意義。本研究從梔子中分離GjERF的cDNA，并分析其在梔子不同組織和發育時期轉錄水平的表達，旨為研究其作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

梔子（Cardenia jasminoides）培養于廣東藥學院，隨著梔子果實的發育，采摘果肉為無色（發育期Ⅰ）及果肉為橙黃色（發育期Ⅱ）的梔子果實。并采摘梔子的成熟葉片。果實及葉片均經液氮中速凍后，冷凍于-80℃。

1.2 方法

1.2.1 梔子cDNA文庫的構建及隨機測序獲得GjERF基因序列 從梔子果實（發育期Ⅱ）中以CTAB［17］改良法提取總RNA，在液氮中研磨梔子果實，加入65℃ CTAB提取液（2％ CTAB（W/V），2％ PVPK30（W/V），100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），25mmol/L EDTA（pH8.0），2.0mol/L NaCl）和 4％（V/V）β-疏基乙醇，保溫30min。接著以12000×g 在4℃離心10min，上清液加等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇（25/24/1，V/V）抽提，接著以12000×g離心20min。水相加等體積4mol/L LiCl溶液沉淀RNA，4℃過夜。以12000 ×g離心20min，RNA沉淀以DEPC水溶解，接以0.1體積的3mol/L NaOAC（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇在-20℃沉淀1h。最后以12000 ×g離心20min，RNA沉淀以75％乙醇洗滌，揮干后以DEPC水溶解?？俁NA用于構建cDNA文庫，采用CreatorTMSMARTTMcDNA文庫構建試劑盒（Clontech公司，美國）構建梔子果實的cDNA文庫，按試劑盒說明書提供的方法操作。梔子的cDNA插入在質粒pDNR-LIB中，轉入Escherichia coli strain DH5α。

在cDNA文庫中，隨機挑取單克隆，分別對每個單克隆進行菌落PCR。挑取單克隆加入到25μL的超純水中，在PTC-200 PCR儀（MJ Research，USA）上加熱至95℃裂解5min，制得裂解液。接著以M13引物對用于檢測pDNR-LIB中的插入序列（CreatorTMSMARTTMcDNA文庫構建試劑盒中提供），即對以上裂解液進行PCR擴增反應。采用PrimeStarTMHS DNA polymerase（TaKaRa公 司， 大連寶生物公司），反應條件為：94℃變性5min，40輪循環的 94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 2min，最后72℃延伸7min。擴增產物以1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將片段長度大于750bp的相應的單克隆挑出進行液體培養，送華大基因完成測序。在隨機測序的序列中獲得了GjERF序列。

為了獲得GjERF基因的ORF序列，設計了以下引物，5'端引物為5'-GGAATTCCATATGTGTGGA GGTGCAATCATCGACG-3'，含有NdeI酶切位點。 3'端引物為5'-CCGACTCGAGTTAATACAGCAGATTAT TAGGCTGCTGGGCT-3'，含有Xho I酶切位點。將含有目的基因的菌種加入含氯霉素抗性的LB培養液，在37℃，150r/min搖床培養過夜。接著以4000r/min離心菌液5min。挑取菌體沉淀加入到50μL的超純水中，95℃裂解5min，制得裂解液。做菌落PCR，得到目的DNA。PCR反應條件為94 ℃變性5min，接 35輪循環的 94℃ 30s，63.5℃ 30s，72℃ 1.5min，最后72℃延伸7min。擴增產物以1.2％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 序列分析和空間結構預測 基因序列中的ORF以及預測編碼蛋白的保守域的搜索以ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/）和 BLAST進行。多重序列比對以在線ClustalW2（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html）進行。進化分析以Mega 4軟件中的neighbor-joining算法完成?？臻g結構預測以SWISS-PDB軟件在線分析完成。

1.2.3 GjERF基因的轉錄水平表達分析 分別取梔子發育期Ⅰ和Ⅱ的果實及梔子的成熟葉片，3種樣品按1.2.1方法提取總RNA，以Prime Script one step RT-PCR試劑盒（TaKaRa，大連寶生物公司），按試劑盒說明書將GjERF的mRNA反轉錄為cDNA。引物為：正向：5'-GCTTCCAAGCTCAGCCTTACTA-3'，反 向：5'- AGATCATCCAGCATCCAGAGAC-3'。RTPCR的內標為梔子的RPS25-1（核糖體小亞基的25-1蛋白，GenBank登錄號GU797554），其擴增引物為：正向：5'- CAGAAGAAGAAGAAGTGGAGCAA-3'，反向：5'- GTTCTTGAACCACTTGATGGTCT-3'。擴增反應進行二次，PCR反應條件均為：94℃變性5min，接 35輪循環的 94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，最后72℃延伸10min。

2 結果

2.1 梔子GjERF基因的克隆

從梔子果實cDNA文庫中隨機篩選獲得梔子乙烯反應元件結合蛋白ERF的cDNA，命名為GjERF，GenBank登錄號為HQ599862。該基因全長962bp，5'端非翻譯區長82bp，3'端非翻譯區長100bp，預測ORF為780bp，編碼259個氨基酸，分子量為28.6kD，等電點為6.764。GjERF基因的ORF擴增結果見圖1。

2.2 GjERF蛋白序列分析和空間結構預測

圖1 GjERF 的ORF擴增電泳圖

圖2 GjERF的聚類分析

通過BLAST分析，GjERF的蛋白質序列含有AP2/ERF結構域，與多種植物的ERF相似。經ClustalW2比對和MEGA4.0分析，得到GjERF與20條在BLAST比對中與GjERF最相似的ERF的親緣關系圖，見圖2。GjERF與唇形超目唇形科的丹參（Salviamiltiorrhiza）的ERF關系最近（序列相似度50.57％），梔子和丹參同屬唇形超目。GjERF與金縷梅超目山毛櫸科的歐洲栗（Castanea sativa）的關系較遠（序列相似度25.86％）。將GjERF與丹參、棉花（Gossypiumhirsutum）、葡萄（Vitis vinifera）、番茄（Solanum lycopersicum）的ERF，以及來自擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtERF1的ERF結構域（在PDB中的編號為1GCC_A，序列范圍145-206）進行了比對，序列相似度分別為50.57％、49.09％、48.39％、44.09％和16.54％；而GjERF的AP2/ERF結構域（序列范圍75-133）與這幾種植物ERF的AP2/ERF結構域的相似度則在68.25％-86.89％范圍，而在此結構域中推測與DNA有相互作用的氨基酸殘基則在所有參比的ERF中完全相同，見圖3。以1GCC_A為模板，由Swiss-model預測的GjERF中AP2/ERF結構域的二級結構也在圖中標出。按照GjERF的序列結構，其N端具有未知功能的MC結構域（MCGGAII），因為這個顯著特征，將其劃分為ERF因子中的第Ⅶ類。

圖 3 GjERF與5個ERF的序列對比

以來自擬南芥的AtE-RF1的ERF結構域（序列范圍145-206）與DNA的GCC盒雙鏈的復合物（即1GCC_A）為模板，該復合物中的DNA編碼鏈序列為：5'-GCTAGCCGCCAGC-3'，劃線序列為GCC盒核心序列，另一條為互補鏈。1GCC_A的蛋白序列與GjERF的ERF結構域（序列范圍75-133）的相似度為75.44％，由該復合物作為模板預測的GjERF的ERF結構域的3D結構，見圖4。

圖4 1GCC-A中ERF結構域與DNA復合物的空間結構及預測的GjERF中ERF結構域的空間結構

在1GCC_A結構中，擬南芥的ERF結構域與GCC盒通過3個β折疊在DNA的大溝處相互作用。從N到C端方向的第二個β-折疊幾乎與α-螺旋平行，也與DNA編碼鏈的5'到3'方向平行。主要涉及的作用有，結構域中的精氨酸的胍基與GCC盒中的鳥嘌呤經氫鍵互相作用，而精氨酸的骨架結構則與嘧啶堿基有疏水性相互作用。色氨酸與嘌呤堿基有疏水性相互作用。這些精氨酸和色氨酸殘基除與堿基作用外，還與糖磷酸骨架有疏水性相互作用。DNA分子則在大溝的CG堿基對有約20℃的彎曲，有利于蛋白質與DNA之間的相互作用。預測的GjERF的空間結構與1GCC_A相似。

2.3 GjERF基因在果實發育過程中的表達

GjERF在梔子成熟葉片，發育期Ⅰ和Ⅱ的果實中的轉錄水平的表達，見圖5。以特異引物擴增cDNA，以梔子RPS25-1作為內標?？煽吹?，GjERF在葉片中的表達水平比在果實中高，隨著果實的發育過程，GjERF轉錄水平的表達維持不變。

圖5 GjERP在葉片和果實兩個發育時期（Ⅰ和Ⅱ）轉錄水平的表達

3 討論

ERF類轉錄因子作為AP2/ERF類轉錄因子中的一類，參與植物多種基因的表達從而調節植物的生長發育和對乙烯、生物和非生物性脅迫的反應。按照其蛋白質一級結構上的特點，有幾種分類方法將ERF 類轉錄因子進一步分類［11，12，18，19］。其中 Nakano等［12］將擬南芥的122個ERF蛋白分為12族，包括Ⅰ-Ⅴ，Ⅵ-Ⅹ，Ⅵ-L和Xb-L。其中第Ⅶ類ERF類轉錄因子在其蛋白序列N端具有MC結構域。

在對第Ⅶ類ERF的研究中發現其在植物不同組織中的表達往往不同，并有多個ERF參與果實的成熟和衰老過程［20］。如番茄的LeERF2屬于第Ⅶ類，它可被乙烯誘導，隨果實的成熟轉錄水平的表達增加，在成熟抑制的番茄突變體Nr（Never-ripe），nor（non-ripening）和 rin（ripening inhibitor）中幾乎不表達［20］。蘋果（Malus domestica）的 MdERF1主要在成熟果實中表達，在其它組織中很少表達［21］。從李（Prunus salicina）中分離得到的PsERF2a和PsERF2b隨果實的發育過程的表達則沒有呈現遞增或遞減的規律，而是在花中高水平表達［22］。在獼猴桃（Actinidia deliciosa）中，AdERF4，AdERF5和AdERF6的表達則是AdERF4、AdERF 6隨果實的發育成熟表達逐漸下降。另外，AdERF4在葉中的表達僅次于果實發育初期的水平；AdERF5的表達水平在所有組織和果實發育過程中均很低，相對的在花和成熟果實中有少量表達［23］。葡萄中的第Ⅶ類的VvERF057、VvERF058和VvERF059在葡萄由轉熟期到全熟期的表達沒有任何變化，而第Ⅸ類的兩個ERF轉錄因子VvERF078和085則與幾丁質酶，β-1，3-葡聚糖酶和甜蛋白隨葡萄果實的發育過程同步表達［24］。對甜瓜品種河套蜜瓜果實中的第Ⅶ類ERF因子CMeERF2的表達的研究發現，隨著果實的發育成熟過程及乙烯含量的增加而逐漸增加，在受粉后38d內其轉錄水平較低，乙烯含量較少；在受粉后40d時，果實內源乙烯含量達到峰值，其轉錄水平也達到峰值；在受粉后45d之后，隨著果實內源乙烯水平的下降，其轉錄水平也下降。同時，也發現不屬于第Ⅶ類ERF因子的CMeERF1的表達也有類似的規律［25］。所以第Ⅶ類ERF因子與果實的發育過程的關系也是復雜的，有時并不相關，而其它亞類的ERF因子也有可能與果實的發育成熟過程有關。本研究獲得的GjERF基因在梔子葉片中的表達強于在果實中的表達，并不隨果實的發育而增強，顯示其表達與果實的發育無關并具有組織特異性。隨著對植物AP2/ERF轉錄因子基因的克隆及基因的表達和功能的研究，將更有助于對植物的抗逆機制和生長發育的調控機理的深入了解。這是首次在梔子中分離ERF類轉錄因子及考察其在不同組織和發育時期表達的報道。

4 結論

克隆了梔子的GjERF基因，該基因預測編碼第Ⅶ類ERF轉錄因子。該轉錄因子的ERF結構域預測可與順式作用元件GCC盒發生相互作用。GjERF在梔子葉中的轉錄水平的表達強于在果實中的表達，并不隨果實的發育而改變其表達水平。

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