月季查爾酮合成酶基因片段的克隆及其表達分析

張云婷 于定群 程怡 湯浩茹 王清明 張勇

在植物的花色成分中，類黃酮、甜菜素和類胡蘿卜素是三類最主要的色素［1，2］，且大多數植物花色素屬于類黃酮［3］。 查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）是類黃酮類物質合成的關鍵酶，在苯丙氨酸合成途徑中，香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 在查爾酮合成酶催化下產生苯基苯乙烯酮［4，5］。此中間物的異構化和功能基團的進一步取代都能導致黃酮、異黃酮和花色素苷的合成。這些化合物為自然界提供了顏色，并參與了植物的多種生理過程，包括防紫外線輻射、抗病、生長素運輸、花粉的育性等［6，7］。查爾酮合成酶的表達受 UV 照射［8］、真菌侵染等條件誘導［9］，且在花中特異性表達［10］，其表達量的改變可能導致植物花色的變異［11］。CHS在植物中是普遍存在的，現認為最早在陸生植物中出現。例如，輪藻綱和苔蘚植物［6，12-15］。 到目前為止在GenBank注冊的與CHS有關的核酸序列已經有5000多條，涉及到的植物主要是豆科的大豆、苜蓿、豌豆；十字花科的擬南芥；禾本科的水稻、玉米；葡萄科的葡萄等，其中觀賞植物主要有矮牽牛、蓮、水仙、菊花、蝴蝶蘭和金魚草等［16］。

CHS轉基因的研究開展得比較廣泛。1986年，Coen 等［17］對金魚草的花色突變體研究表明，突變體花色變淡或變淺藍色，并推測該現象由CHS基因所控制。1990年 van der Krol等［18］將 CHS基因反義片段導入矮牽牛，結果花朵色素合成受阻，花冠顏色變淺，但花藥正常。1993年Elomaa等［19］利用農桿菌介導法將 CHS 基因反義片段導入非洲菊（Gerberahybrida）中，內源CHS合成受到抑制，花色合成大大受阻，從而使花色發生改變。1994年Gutterson 等［20］利用正義和反義手段，將來自菊花（Chrysanthemummorifolium）的一個CHS基因導入開粉紅色花的菊花中，結果分別獲得了開淺紅色和白色花的轉基因植株。2000年Suzuki等［21］將CHS基因轉入藍色夏中，花瓣部分花色由藍色變為白色。2005年Koseki等［22］在mRNA水平上分析了矮牽牛Red Star 6個花色苷生物合成過程中的重要基因發現，只有CHS基因的表達受到抑制才使花冠形成紅白相間的現象；2006年祝欽攏［23］將彩葉草CHS基因轉入煙草中，煙草葉片出現了色斑。從以上結果可以看出，CHS在植物花色呈現過程中的重要作用。

長期以來月季的品種改良一直依賴于傳統的遺傳育種方法，關于通過調控CHS基因的表達量來改變月季的花色報道較少。基因工程技術在觀賞植物花色育種上可彌補傳統育種技術的缺陷，可在保持原有性狀的基礎上，改變觀賞植物的花色，甚至創造該物種所不具有的花色，在較短時期內培育出穩定遺傳的新品種、新類型，孕育著巨大的經濟效益。另一方面它也是研究基因表達、調控和互作機理的熱點課題。鑒于此，本試驗希望通過克隆得到月季CHS基因序列及其表達分析，為進一步花色基因工程作準備。對月季進行品種改良，使其花色更加多樣化，在園林上具有更好的觀賞價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 ‘仙境’月季（Rosahybrid）由四川農業大學園藝學院提供，在晴朗的上午10點左右采集月季初開期（S1）、盛開期（S2）、衰敗期（S3）中層花瓣后，進行液氮速凍，置于-80℃保存備用。

1.1.2 試劑 3％ CTAB，PVP，75％乙醇，氯仿，異丙醇，DEPC處理水，反轉錄試劑盒（Fermentas），瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（生工生物上海有限公司），Easy-GoTMRT PreMix（北京賽百盛基因技術有限公司），pMD19-T vector（寶生物工程大連有限公司），大腸桿菌感受態細胞JM109（寶生物工程大連有限公司），LB平板培養基以及其他常用試劑。

1.1.3 儀器 超低溫冰箱（Thermo，美國）、超純水系統（F4PN84631，MILLIPORE）、全自動高壓滅菌鍋（TOMY，日本）、PCR（Polymerase Chain Reaction）儀（Bio-Rad，美國）、低溫高速離心機（Eppendorf，德國）、超凈工作臺（SW-CJ-2FD 型，蘇州安泰）、凝膠成像系統（SYNGENE，美國）、恒溫搖床（HQL150C 型，武漢中科）、恒溫箱、電泳儀（北京六一儀器廠）、電泳槽、電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫療器械廠）、微波爐等。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一條鏈的合成 花瓣總RNA的提取采用改良后的CTAB法［24］，在RNA提取過程中防止RNA污染，減少降解。按照反轉錄酶使用方法進行合成 cDNA 第一條鏈，20μL PCR 反應體系，此過程在冰上進行。

1.2.2 查爾酮合成酶基因cDNA片段的克隆與測序 根據GenBank上已登錄的 CHS 同源基因的蛋白質保守序列，利用CODEHOP軟件設計了一對簡并引物，引物由上海生物工程有限公司合成。

引物：RhCHSF：5'-CCKTCHYTGGAYGCNMGRCARGAC-3'；RhCHSR：5'-GGBCCRAANCCRAANARMACACC-3'。對月季花瓣總RNA經反轉錄后合成的第一條鏈cDNA進行擴增。擴增程序為：94℃預變性3min；94℃變性1min，47℃退火1min，72℃延伸1min，34個循環；72℃延伸10min；12℃保存。擴增產物電泳檢測后用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的條帶，將回收產物與克隆載體pGEM-T easy連接，轉化大腸桿菌JM109，用藍白斑篩選重組子，篩選出陽性克隆及 PCR 檢測，選取經鑒定含有目的片段的菌液送至測序。測序由上海英駿生物公司完成。

1.2.3 表達分析 采用半定量RT-PCR的方法，把月季在初花期（S1）、盛花期（S2）、衰敗期（S3）所提取的總RNA進行反轉錄后，合成單鏈cDNA。利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，調整PCR 反應模板量。根據RhCHS序列，設計一對特異引物RhCHS forward 和reverse，引物RhCHSF：5'-CGACTACTACTTCCGTAT-3'；RhCHSR：5'-TTCAACAACCACCATATC-3'。擴增程序為：94℃預變性3min；94℃變性1min，47℃退火1min，72℃延伸1min，36個循環；15℃保存。

2 結果

2.1 總RNA的質量檢測

從月季花瓣中提取的總RNA近無色，不呈膠狀，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像儀觀察發現，在 RNA 條帶附近及點樣孔周圍沒有發亮現象，初步鑒定樣品基本不含多酚、蛋白質等雜質；同時，如圖1所示，28S，18S和5S 條帶條帶清晰干凈，條帶之間不彌散。其中28S RNA條帶的亮度為18S RNA條帶的2倍，說明提取得到的總 RNA 完整性好。紫外分光光度計測定，A260/A280=1.91，A260/A230=1.79表明提取的總 RNA 樣品較純凈，樣品中多酚及蛋白質的含量等雜質很少，無 DNA污染。以上說明改良后的CTAB法適合月季花瓣 RNA的提取，且提取的總RNA 質量較高，可用于后續試驗。

圖1 提取的月季花瓣總RNA電泳圖

2.2 CHS基因cDNA保守區序列的PCR擴增

以逆轉錄合成的cDNA 第一鏈為模板，利用一對簡并引物RhCHSF和RhCHSR進行保守區擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳，可見一條約850bp 的條帶（圖2）。對該片段進行回收、連接轉化、測序，得到一段860bp的cDNA 序列與預期片段長度一致。通過 Blast程序，與GenBank 上的其他植物的比較分析，該片段序列與已登錄月季品種（Kardinal：AB038246.1；Xing-xing-hei：HQ423171.1）、草莓（Fragaria×ananassa：AB201758.1）、樹莓（Rubus idaeus：AF400567.1）、 懸 鉤 子（Rubushybrid：JN602374.1）、碧桃（Prunus persica：JN391444.1）等植物的同源性達到 98％、92％、92％、87％和87％，推測該序列為CHS基因cDNA 的同源片段（表3）。

圖2 月季 CHS基因保守區序列擴增電泳圖

表3 月季與其他薔薇科植物CHS基因同源性比較

2.3 不同時期月季查爾酮合成酶基因（CHS）的表達

采用RT-PCR的方法對CHS在月季花發育過程中的表達變化進行分析，通過凝膠電泳（圖3）可以看出，衰敗期的CHS表達量幾乎沒有，而盛花期的表達量最高，CHS從初花到衰敗呈現出先上升后下降的趨勢，與其花瓣顏色變化相一致，這是由于CHS影響花色素的積累。

3 討論

進行分子生物學試驗提取高質量的RNA是最首要和關鍵一步，在提取RNA的過程中通常會受到污染物的干擾。植物組織中富含的糖、酚類、蛋白質、植物次生代謝物質，DNA等限制了高質量RNA的分離［25，26］。目前，大多采用 CTAB 法提取 RNA［27-29］。本試驗用的材料是花瓣，色素等次生代謝物質較多，分離純凈的RNA難度較大，所以采取了改良后的CTAB法，通過凝膠電泳和分光光度法對提取的RNA進行檢測，3條帶清晰完整，RNA的A260/A280在 1.8-2.0范圍內，質量較好，符合后續試驗的要求，且該方法簡單易行，耗時短。

將克隆得到的核苷酸基因序列翻譯成氨基酸序列，提交NCBI在線用BLAST 進行搜索比對，RcCHS與其他植物有較高的同源性，說明CHS在進化過程中的保守性。PCR擴增遵循酶促反應定律，開始的循環內擴增產物呈指數累積，產物和模板呈線性關系；當達到平臺效應時，隨著循環次數的增加，產物產率不再增加。半定量RT-PCR正是利用產物和模板的這一線性關系，通過擴增來對比目的基因的表達。結果顯示，月季花瓣初開到衰敗，查爾酮合成酶基因表達的規律，先上升后下降，在盛花期達到峰值，衰敗期幾乎無表達，可能因為植物后期代謝減緩，物質分解消耗等原因。CHS基因是一個較大的基因家族，研究表明，在大部分植物當中CHS存在多拷貝，在同源基因之間的表達呈現差異特性。例如，擬南芥中CHS基因在花、葉、果中都有表達［30］，而矮牽牛中的CHSA和CHSJ只在花粉囊和花冠中特異表達［31］。在一些植物中CHS在不同的發育時期表達的位置也不相同。在一些植物的早期發育階段，CHS出現在葉片組織中［32］，而成熟植株中主要限于花組織中表達［33］。CHS基因在同一器官中的表達部位也不盡相同。2006年，Mahroug等［34］通過原位雜交技術，表明長春花CHS基因在花瓣的上表皮表達。而有些植物的CHS基因則在花藥中表達。2010年，宋婷婷等［35］在蘋果屬觀賞海棠 McCHS 基因的克隆及實時定量研究中推測CHS的相對表達量在整個葉片的發育過程中會逐漸發生改變或者發生不同部位、器官的特異表達。大量研究表明，CHS基因表達模式受到外界環境因子、上游啟動子序列和轉錄因子共同調控。

本研究克隆到了月季花瓣查爾酮合成酶基因的片段，為以后獲得CHS全長奠定了基礎，同時探索了月季不同發育時期CHS的表達情況，為其著色機理和分子育種提供了理論基礎。

4 結論

從月季（Rosahybrida）花瓣中成功提取出總RNA，獲得RhCHS的cDNA片段長度為860bp，編碼287個氨基酸殘基，GenBank登錄號KC145553。同源序列比對發現，月季RhCHS與其他植物的同源性很高，說明CHS 在進化的過程中具有高度的保守性。表達譜分析表明，CHS在盛花期表達量最高。

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