絨山羊DBY基因的BAC篩選與序列分析

肖紅梅 肖旭 劉志紅 李金泉

DBY（DDX3Y，DEAD box on the Y）基因是精子發生中起關鍵性作用的基因之一，在動物繁殖育種中起著重要作用［1，2］。它位于哺乳動物Y染色體的AZFa區［3，4］，是AZFa區最主要的候選基因。編碼一個ATP依賴性RNA解螺旋酶，屬于DEAD（天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列）盒蛋白家族的成員，參與細胞的各種過程，包括剪接，核糖體合成和RNA降解等［5］。人的DBY基因位于USP9Y基因下游45 kb處，含有17個外顯子，其編碼的mRNA在睪丸組織中特異表達，主要見于精子和粗線期的精母細胞中，DBY的缺失可導致生精細胞的嚴重減少甚至完全缺乏，顯示的病理性表型為生精細胞生長障礙，而且在AZFa區中DBY的缺失率比 USP9Y 高［6-8］。Kleiman等［9］通過無精癥患者組織檢查發現：精子發生障礙時，DBY基因轉錄物表達不足。因此，DBY基因微缺失在AZFa區缺失類型中極具代表性。Foresta等［8］在對精子生成障礙患者進行睪丸活檢時發現，DBY缺失的患者表現為I型唯支持細胞綜合征和小睪丸癥，即僅有支持細胞而無精原細胞。同時在對小鼠體的同源基因DBY研究也同樣發現，DBY的缺失導致小鼠精子發生障礙［10，11］，證明了DBY對睪丸精子發生的重要作用。

但迄今為止，DBY基因在生殖細胞發育中的具體作用還不清楚。為此，國內外的一些專家對哺乳動物DBY基因進行了研究，但由于Y染色體結構復雜，存在大量的重復序列，難于組裝，所以研究的物種很少，大量集中于對人的研究，而對絨山羊的研究尚未見報道。因此，本試驗對絨山羊Y染色體DBY基因進行了篩選與測序，旨在為進一步研究DBY基因在絨山羊Y染色體上的定位、分析其在精子發生中的作用機理以及基因進化提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

絨山羊BAC文庫由內蒙古農業大學動物遺傳育種實驗室提供，血液采集于鄂爾多斯羊場隨機選取的10頭絨山羊（5公，5母）的頸靜脈血。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的制備 選100-120μL抗凝血加雙蒸水至1.5mL，充分混勻，冰浴10min后12000r/min離心1min，棄上清，向下層沉淀中加100μL

雙蒸水使之充分懸浮，煮沸10min，立即冰浴5min，以12000r/min離心5min，取上清于另一個離心管即可用于PCR檢測，于-20℃保存備用。

1.2.2 引物設計 以GenBank收錄的牛的DBY序列為模板，應用軟件Primer設計引物并由上海生物工程有限公司合成。上游引物序列：5'-tcatctgttggaacttttc-3'；下游引物序列：5'-atctccttggttttagcc-3'。

1.2.3 PCR擴增條件 以建庫的內蒙古絨山羊基因組為模板，通過正交拉丁設計方法確定DBY基因最佳的20μL PCR反應體系為：上下游引物（10 pmol/μL）各為0.5μL，絨山羊基因組DNA模板（30ng/μL）1.1μL，10×buffer 2μL，dNTP 2.1μL，Taq DNA 聚合酶 0.3μL，超純水13.5μL。PCR 反應循環程序：94℃預變性5min；94℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸 45s，32個循環；72℃延伸 5min，4℃保存。PCR產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 超級池的篩選 根據已確定的擴增條件，以絨山羊基因組BAC文庫的超級池DNA為模板，加一個陽性對照（以已擴增出的基因組為模板）、一個陰性對照（以滅菌超純水為模板）和一個絨山羊的雌性基因組對照，進行PCR反應，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，篩出DBY基因所在的二級池編號。

1.2.5 二級池篩選 以超級池篩選出的陽性二級池DNA為模板，通過PCR反應（反應條件同篩選陽性超級池的條件）篩選DBY基因所在的板池、行池、列池，并加陰陽性對照。PCR產物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得二級池的板池、行池、列池的陽性克隆編號。

1.2.6 陽性克隆、測序 依照二級池的PCR篩選結果，確定DBY基因陽性克隆在BAC文庫中的位置，從-80℃冰箱中取出凍存的菌樣，挑取文庫中的目的菌落，在含有氯霉素（12.5μg/mL）的 LB平板上劃線，37℃恒溫培養，得到包含DBY基因的陽性單克隆并鑒定。然后把PCR產物純化、回收，連接到T載體上，并將連接產物轉化到大腸桿菌中，通過藍白斑篩選，將陽性克隆進行劃線培養并進行菌體PCR陽性檢測。對檢測得到的陽性克隆菌液培養過夜，將菌液送交上海生工進行測序。

1.2.7 系統進化樹的構建 利用Mega5軟件，根據與山羊同源物種的DBY基因序列建立物種間的NJ系統樹（Neighbour-joining tree），進行進化分析。

2 結果

2.1 超級池篩選

以稀釋10倍的超級池DNA為模板54℃擴增，擴增產物用1.5％瓊脂糖凝膠進行檢測，在凝膠成像系統下觀察PCR 擴增情況，結果如圖1所示。從凝膠電泳圖可以看出，通過PCR 擴增得到陽性二級池有兩個，分別為S21（泳道5）和S24（泳道8），經過多次檢驗，最終確定S21為所需條帶。其條帶單一而且明亮并與雌性對照條帶大小不同。擴增的片段大小為240bp左右。

2.2 二級池篩選

將陽性二級池S21稀釋10倍后，取4μL做PCR模板，擴增二級池。PCR反應條件同超級池。擴增產物用1.5％瓊脂糖凝膠進行檢測，結果如圖2所示。

圖1 DBY超級池篩選

圖2 DBY二級池篩選

根據S21池行、列、板池的定位結果，得到DBY基因在基因組BAC文庫中的位置為行池D、4列池3、6列池6、板池5，定位于405D22。

2.3 菌體PCR鑒定

從文庫中找到405D22的陽性克隆，在1mL的LB培養基（加有氯霉素12.5μg/mL）中，37℃恒溫培養24h，之后做菌體PCR鑒定。為得到更好的克隆結果排除假陽性，菌落PCR時，做了3個平行的菌落，結果（圖3）顯示，所得到的菌體PCR產物條帶很清晰，且與目的條帶大小一致，可鑒定出獲得的單克隆為陽性。然后選取條帶最清晰的菌，進行后續的膠回收工作。

圖3 DBY菌體PCR鑒定

2.4 PCR產物回收、菌體重組質粒鑒定

將菌體PCR產物（圖4）切膠回收、純化后，用紫外-可見分光光度計檢測DNA純度，OD值（A260/A280）為1.87，膠回收效果較好，可用于亞克隆鑒定。

圖4 膠回收電泳檢測

2.5 克隆鑒定

將回收的菌體PCR產物用pEASY-T1載體連接，轉化后，37℃培養過夜，挑取單克隆劃線，做菌體PCR鑒定陽性克隆，結果如圖5所示，菌體PCR產物條帶與目的基因條帶一致，清晰可見，說明轉化成功，可用于亞克隆測序。

圖5 DBY克隆鑒定

2.6 DBY克隆測序

經序列測序，得到引物擴增基因組產物片段長度為240bp，序列堿基組成如圖6所示。該序列中A+T和G+C含量分別為70％和30％，A+T的含量相對較高。與GenBank收錄的其他物種序列進行比對：與綿羊DBY基因的同源性為96％；與坡鹿、水牛的同源性達93％；與豬鹿、瘤牛和牛的同源性分別達92％和91％；而與人和黑猩猩及小鼠的序列無同源性。此片段長為240bp，包括長為186bp的內含子和54bp的外顯子，共編碼52個氨基酸。篩選出的BAC為Y染色體基因組片段。

圖6 DBY堿基序列

2.7 進化分析

從構建的NJ系統進化樹（圖7）可看出，首先山羊和綿羊、野牛和瘤牛的親緣關系最近，分別屬于哺乳動物偶蹄目、?？蒲騺喛坪团喛?；其次是泰國坡鹿和緬甸坡鹿的親緣關系較近，屬于偶蹄目的鹿科、鹿亞科；最后，它們與屬于豬科的豬鹿、?？频乃＞蹫橐活?，親緣關系相對較遠。

圖7 哺乳動物偶蹄目DBY基因NJ系統進化樹

3 討論

本實驗室構建的絨山羊細菌人工染色體BAC文庫保存在720個384孔板中，每個超級池由20個384孔板組成。以超級池為單位提取文庫DNA，分別得到超級池DNA 36個，二級池DNA 1 656個，每一個超級池含有二級池DNA 46個，其中板池20個，行池16個，4列池4個，6列池6個，共有288個行池、180個列池、360個板池，含有27×104個克?。?2］，因此精確的定位對于獲得正確的陽性克隆至關重要。本研究在BAC文庫的定位PCR篩選過程中，由于文庫具有11.8倍的覆蓋率，所以首先必須保證合適濃度的篩庫工作液，其次要有優化的擴增體系和擴增條件，因此需要對擴增的體系和條件進行大量的摸索工作，得到最優化體系。但由于在設計引物時，沒有山羊的模板序列，選用GenBank收錄的牛DBY基因序列設計引物，引物的特異性不強，在進行PCR擴增時，體系難以建立，所以在篩庫中，基因難以定位。為了加快篩庫速度，提高效率，采用正交拉丁方優化體系，并經過驗證，方法可行。通過優化的擴增體系和條件所得的陽性克隆經測序為目的克隆。而且此研究獲得的Y染色體DBY基因片段填補了山羊該基因序列空白。通過序列比對，DBY基因在牛科動物中具有一定的保守性，而與其他物種的保守性很差，尤其與人和黑猩猩及小鼠的序列無同源性，而人和小鼠之間DBY卻有較高的相似性［6］。NJ系統進化樹得出山羊、綿羊、水牛等物種間在NJ系統進化樹中所反映的親緣關系同其在分類學中的位置基本一致［13］。Foresta等［6］在對人類Y染色體AZFa區基因進行研究時發現DBY有17個外顯子，編碼一個ATP依賴的RNA解旋酶，屬于DEAD BOX（Asp-Glu-Ala-Asp）家族。但本研究所得的片段中編碼序列無天冬氨酸編碼，與其有差異。這可能是由于克隆片段的編碼序列太短，基因序列不完整造成的，也可能是由于山羊和人及小鼠的同源性差，編碼序列不同的緣故。因此，山羊的DBY基因的結構、進化及功能還有待進一步研究。后續將對獲得的405D22 BAC測序，并對測序序列進行生物信息學分析。并以此BAC末端序列為模板設計引物，進行絨山羊Y染色體其他BAC的篩選，獲得山羊Y染色體功能區序列，逐步構建Y染色體序列的contig。

4 結論

首次獲得山羊Y染色體DBY基因片段240bp，共編碼52個氨基酸；其與綿羊、牛的同源性較高，而與人、黑猩猩及小鼠無同源性；經鑒定篩選出的405D22基因組BAC為山羊Y染色體BAC。

［1］ Foresta C, Moro E, Ferlin A.Y Chromosomemicrodeletions and alterations of spermatogenesis ［J］.Endocrine Reviews, 2001, 22（2）：226-239.

［2］ Tiepolo L, Zuffardi O.Localization of factors controlling spermatogenes is in the nonfluorescent portion of thehuman Y chromosome long arm ［J］.Hum Genet, 1976, 34（2）：119-124.

［3］ Vogel T, Speed RM, Ross A, Cooke HJ.Partial rescue of the Dazl knock outmouse by thehuman DAZL gene ［J］.Mol Hum Reprod,2002, 8（9）：797-804.

［4］ Mazeyrat S, Saut N, Sargent CA, et al.Themouse Y chromosome interval necessary for spermatogonial proliferation is gene dense with syntenichomology to thehuman AZFa region ［J］.Hum Mol Genet,1998, 7（11）：1713-1724.

［5］ Liu WS, Wang A, Yang Y, et al.Molecular characterization of the DDX3Y gene and itshomologs in cattle ［J］.Cytogenet Genome Res, 2009, 126（4）：318-328.

［6 ］ Foresta C, Ferlin A, Moro E.Deletion and expression analysis of AZFa genes on thehuman Y chromosome revealed amajor role for DBY inmale infertility ［J］.Hum Mol Genet, 2000, 9（8）：1161-1169.

［7 ］ Gueler B, Sonne SB, Zimmer J, et al.AZFa protein DDX3Y is differentially expressed inhumanmale germ cells during development and in testicular tumours：new evidence for phenotypic plasticity of germ cells ［J］.Hum Reprod, 2012, 27（6）：1547-1555.

［8 ］ Kleiman SE, Yogev L, Hauser R, et al.Expression profile of AZF genes intesticular biopsies of azoospermicmen ［J］.Hum Reprod,2007, 22（1）：151-158.

［9 ］ Foresta G, Moro E, Rossi A, et al.Role of the AFZa candidate genes inmale infertility［J］.J Endocrinao Invest, 2000, 23（10）：646-651.

［10 ］ Yao CJ, Xu WJ, Gong XL, et al.The role of DbymRNA in early development ofmalemouse zygotes ［J］.Asian Journal of Andorlogy, 2010, 12（4）：567-577.

［11］ Vong QP, Li Y, Lau YF, et al.Structural characterization and expression studies of Dby and itshomologs in themouse ［J］.J Androl, 2006, 27（5）：653-661.

［12］ 劉志紅.絨山羊BAC文庫的構建與鑒定以及絨毛生長發育相關基因的篩選［D］.呼和浩特：內蒙古農業大學, 2009.

［13］ 常洪.動物遺傳資源學［M］.北京：科學出版社, 2009.