虹鱒MHC-UBA基因遺傳多樣性分析

胡丹丹 劉哲 邵淑娟 楊娟 王建福

虹鱒（Oncorhynchusmykiss）在分類學上屬鯡形目、鮭科、大麻哈魚屬，是一種冷水性魚類，原產美國加利福尼亞，1874年經人工移植馴化在世界許多地方養殖。中國黑龍江省1959年首次從朝鮮引進虹鱒進行養殖，目前中國已有20多個省（市）開展了虹鱒養殖［1］。隨著養殖規模的不斷擴大，一些惡性傳染性疾病流行的機會增大，而且在有些地方已經形成嚴重危害，因此開展虹鱒抗病功能基因的研究，進而通過分子標記進行抗病育種，在預防和控制疫病的流行和蔓延方面具有非常重要的意義。

主要組織相容性復合體（majorhistocompatibility complex，MHC）基因是存在于脊椎動物體內編碼MHC分子的一類基因家族，具有高度多態性。其編碼產物是一種位于細胞表面的糖蛋白，廣泛參與免疫應答的誘導和調節，因此與動物對疾病的抗性和易感性密切相關，在免疫學上具有極為重要的意義［2］。因其具有高度的多態性，因此也是研究脊椎動物適應性進化的候選基因之一［3］。按照MHC基因編碼蛋白分子的不同可以分為3類，分別為MHCⅠ類分子、MHCⅡ類分子和MHC Ⅲ類分子。MHCⅠ類分子是由 α鏈（α1、α2、α3）和β2-微球蛋白（β2m）通過非共價鍵形成的異二聚體，α1和α2結構域構成槽型的抗原肽結合區，分別由MHCⅠ類基因的第2和第3外顯子區編碼，主要負責內源性抗原（如病毒）的加工和呈遞，將內源性抗原肽呈遞給CD8+細胞毒性T細胞。

最早對MHC的研究是在20世紀50年代，從小鼠等哺乳動物開始的。魚類MHC研究起步較晚，1990年，Hashimoto等［4］率先克隆了鯉魚MHCⅠ基因，隨后，在許多魚類中都發現MHC多態性與機體抗病力密切相關，如牙鲆（Paralichthys olivaceus）［5］、大西洋鮭（Salmo salar）［6］、虹鱒（Oncorhynchusmykiss）［7］、歐江彩鯉（Cyprinus carpiovar Color）［8］等，因此MHC的研究已成為魚類分子免疫學和魚類抗病輔助育種的研究熱點之一。目前挪威和澳大利亞的科學家已利用MHC基因作為分子標記成功地篩選出了大西洋鮭的抗病品系［6］。

虹鱒MHCⅠ類基因家族包括Ⅰa區和Ⅰb區，UBA基因為Ⅰa區的一個經典的有義基因座位，位于18號染色體的長臂［9］，包括7個外顯子和6個內含子［10］。Dijkstra等［11］發現虹鱒被傳染性造血器官壞死病病毒（infetioushaematopoietic necrosis virus，IHNV）感染后，UBA 基因在性腺細胞系中的表達量上升；Landis等［12］發現，虹鱒在被病毒感染后，Ⅰ類 b區基因（ 包 括 UAA、UCA、UDA、UEA和UGA）的表達量也上升，說明了MHCⅠ類基因在虹鱒抵抗病毒感染方面具有重要作用。本研究采用聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態性（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）和克隆測序的方法分析了虹鱒UBA基因第2外顯子多態性，以期為進一步篩選抗病相關的分子標記，并進行虹鱒抗病育種工作奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用184尾虹鱒來自于同一養殖條件。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取肌肉組織用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，TE溶解，經1％瓊脂糖凝膠檢測，-20℃保存備用。

1.2.2 引物設計和PCR擴增 引物設計參照Gen-Bank中虹鱒MHC基因序列（登錄號AB162342），通過Primer Premier 5.0軟件設計上游引物UBA-F：5'-TGTCTACCTTACAGCTACGC-3'，下游引物UBA-R：5'-CTCACCTCCAGTCTGATTG-3'（TaKaRa合 成 ）。PCR反應體系25μL，包括模板基因組DNA 1.0μL，上 下 游 引 物 各（10 pmol/μL）1.0μL，dNTP（2.5mmol/L）1.0μL，10×buffer（ 含 Mg2+）2.5μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2μL，ddH2O 18.3μL。PCR反應程序：94℃ 3min；94℃ 30s，55.5℃ 30s，72℃30s，32個循環；72℃延伸10min。經2％瓊脂糖凝膠檢測，-20℃保存備用。

1.2.3 單鏈構象多態性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析 取 2μL的 PCR產物，加入8μL的變性上樣緩沖液（98％去離子甲酰胺、0.025％溴酚藍、0.025％ 二甲苯青、10mmol/L EDTA）。98℃變性10min，迅速冰浴10min后上樣于非變性聚丙烯酰胺凝膠中，電泳所用聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶N，N'-亞甲雙丙烯酰胺=39∶1）濃度為12％。電泳條件為室溫（約12℃）250 V預電泳30min，然后160 V電泳18h，電泳結束后銀染法顯帶。具有相同帶型的個體可推斷其基因型相同。

1.2.4 目的片段膠回收和克隆測序 對不同SSCP帶型個體PCR產物進行分離純化，將所得片段與pMD19-T載體（TaKaRa）連接，并轉入大腸桿菌DH5α菌株（Tiangen）。通過菌液PCR擴增篩選陽性克隆，每個樣品隨機挑取8個陽性克隆，由上海生物工程有限公司測序。

1.2.5 等位基因命名 等位基因命名參考哺乳動物及其它脊椎動物中廣泛采用的MHC基因命名規則［13］，即在位點名稱后用一個星號“*”和數字代表一個特異的等位基因，星號前為基因座位，星號后為等位基因。等位基因的分型以MHC基因同源序列所編碼氨基酸間的錯義替換超過或等于5個殘基作為一個等位基因主型，少于5個殘基的變異作為主型中的一個亞型。如等位基因Onmy-UBA*0201，Onmy代表虹鱒拉丁學名兩個單詞前兩個字母，UBA表示MHC的Ⅰ類a區的一個基因，前兩位數字“02”表示該等位基因所屬的等位基因主型，后兩位數字“01”表示亞型。

1.2.6 數據統計分析 獲得的序列通過NCBI中的BLAST同源檢索，確認是否為目的片段。用MEGA5.0軟件分析核苷酸序列和氨基酸序列的變異位點、平均堿基組成、平均氨基酸含量、密碼子使用頻率，確定等位基因個數，并構建鄰接（Neighbor-Joining，NJ）系統發生樹（選擇Kimura兩參數模型，用Bootstrap法進行1000次評估）。用DnaSP5.10.01軟件Jukes ＆ Cantor模型計算UBA第2外顯子整個序列，PBR區和Non-PBR區核苷酸同義替換率（dS）和非同義替換率（dN）。使用U檢驗進行選擇壓力檢測。

2 結果

2.1 虹鱒UBA基因第2外顯子PCR擴增及SSCP分型結果

利用引物UBA-F、UBA-R對虹鱒UBA基因第2外顯子進行擴增，得到一條280bp左右的特異性條帶（圖1），經測序，包含第2外顯子的全部序列（261bp）。所有PCR產物經SSCP分析后，獲得6種不同的帶型。

圖1 虹鱒UBA基因第2基因外顯子PCR產物檢測

2.2 虹鱒UBA基因第2外顯子等位基因數

對6種帶型對應的樣品進行克隆后測序（共測序48個克隆，每個樣品8個克隆），檢測到虹鱒UBA基因第2外顯子等位基因12個（GenBank中序列登錄號：JX136662-JX136673）。除Onmy-UBA*0106與GenBank中登錄號為AB162342的UBA第2外顯子序列相同外，其余11個為首次發現。單個個體所包含的等位基因數為1-4個（表1），有70個個體只檢出1個等位基因，等位基因數為3和4的個體數分別為41和73，未檢出等位基因數為2的個體。

表1 個體中UBA基因外顯子2等位基因數及相應的個體數

2.3 虹鱒UBA基因第2外顯子核苷酸和氨基酸序列的變異

261bp的核苷酸序列比對后發現存在16個核苷酸變異位點（圖2），變異百分率6.13％，變異范圍1-4個位點。氨基酸序列比對后發現86個氨基酸殘基存在15個變異位點（圖3），占17.44％，變異范圍在1-4之間。PBR區核苷酸變異百分比為6.25％，氨基酸變異百分比為18.75％，Non-PBR區核苷酸變異百分比為6.10％，氨基酸變異百分比為17.14％。虹鱒UBA基因第2外顯子等位基因Onmy-UBA*0103和Onmy-UBA*0105測序部分峰圖序列比較，圖中顯示了第2外顯子的31bp和49bp處分別發生了T/C和A/G突變（圖4）。

2.4 虹鱒UBA基因第2外顯子等位基因密碼子使用情況

虹鱒UBA基因第2外顯子密碼子的使用存在明顯的偏倚現象，其中CAG使用頻率最高，為8.02％，其次是ACU、GAC分別為5.70％、5.58％。并且多個同義密碼子的使用也表現出了偏倚性，例如編碼亮氨酸（Leu）的6個密碼子中，CUG使用頻率達到了95.24％，CUU使用頻率為4.76％，而其他的4種密碼子卻沒有使用（表2）。在所編碼的氨基酸序列中，只有等位基因UBA*0201含有20種氨基酸，其它等位基因均不含半胱氨酸（Cys）。且氨基酸平均含量有較大差異，如：天冬氨酸（Asp）平均含量為9.06％，而半胱氨酸（Cys）平均含量為0.11％。

圖2 虹鱒UBA基因第2外顯子核苷酸序列分析結果

圖3 虹鱒UBA基因第2外顯子氨基酸序列分析結果

圖4 虹鱒UBA基因第2外顯子測序部分峰圖

表2 虹鱒Onmy-UBA基因第2外顯子等位基因密碼子的使用

2.5 選擇壓力檢測

UBA基因第2外顯子全序列dN與dS分別為0.012 6和0.002 9，PBR 區dN為0.014 3而dS為 0，Non-PBR區dN與dS分別為0.012 4和0.003 6。用U檢驗進行選擇壓力檢測的結果是，全序列、PBR區和Non-PBR區的dN都極顯著大于dS（P＜0.001）（表3）。

表3 UBA 基因第2外顯子、PBR區、Non-PBR區核苷酸同義替換率和非同義替換率

2.6 UBA基因第2外顯子等位基因間系統發生分析

采用MEGA5.0軟件根據等位基因間核苷酸序列變異構建鄰接系統發育樹，分析了本研究所發現的

虹鱒Onmy-UBA基因第2外顯子序列（JX136-662-JX136673）和從GenBank下載的大西洋鮭Sasa-UBA基因部分第2外顯子序列（JN561333，JN561336，JN561337，JN561338，AY762573，AY762575，AY762583，AY762587，AY762589，AY762593，AY762595，AY762597） 以 及 斑 馬 魚Dare-UBA基因（NM131471，BC164159）之間的系統發生關系。結果（圖5）顯示，虹鱒和大西洋鮭UBA基因起源于同一分支，尤其是等位基因Sasa-UBA*3101和Sasa-UBA*2501與Onmy-UBA基因表現為高度同源性，表明虹鱒與大西洋鮭UBA基因的親緣關系較近。

圖5 Onmy-UBA，Sasa-UBA和Dare-UBA基因第2外顯子鄰接系統發育樹

3 討論

3.1 MHC基因多態性

MHC作為脊椎動物基因組中高度多態的區域，不同物種間基因座位數有所不同［14，15］。本研究從單個個體擴增出等位基因數為1-4個，暗示虹鱒UBA基因至少存在兩個拷貝位點。已往研究認為虹鱒MHCⅠ類基因包括Ⅰa區和Ⅰb區，Ⅰa區僅存在一個經典的UBA基因座，Ⅰb區包含UAA、UCA、UDA、UEA、UFA、UGA，其中 UFA為假基因。且Ⅰb區基因起源于Ⅰa區基因，由UBA復制后轉化而來［16，17］。本研究發現的UBA多座位現象不同與以往的研究。等位基因數為4的虹鱒有73尾（表1），說明擴增結果并非偶然。為排除擴增結果為Ⅰb區基因的可能，將UBA（JX136662）與UAA（AF091779）、UCA（AB162343）、UDA（AB162343）、UEA（AB162343）、UFA（AY071855）、UGA（HM208332）第2外顯子序列進行比對，序列同源性分別為46.12％、67.44％、67.05％、54.92％、65.13％和62.45％，而UBA基因外顯子2的12個等位基因之間同源性為98.08％-99.23％。說明本研究所設計的引物特異性較高，擴增目的片段為UBA基因第2外顯子。其存在多座位的原因可能來源于染色體的復制，有研究表明現存二倍體虹鱒的祖先為四倍體，虹鱒在進化過程中MHC經歷了復制事件，而且與四倍體發生時間相近［18］。Kiryu［19］認為外顯子改組可能會導致虹鱒UBA基因存在另一拷貝位點，但對此還需要進一步的研究證明。有關MHCⅠa區基因多座位的現象在斑馬魚（Danio rerio）［20］、大西洋鮭［21］和青（Oryzias latipes）［22］中已得到證實。

此外，MHC多態性還表現在每個基因座都存在大量的等位基因。王海燕等［23］研究發現青石斑魚的MHC I類的5個等位基因，Grimholt等［24］分別在大西洋鮭和金頭鯛中發現了UBA的12個和2個等位基因。夏春等［25］對草魚 MHCⅠ類基因研究也發現，α1和α2區域存在大量插入/缺失突變。本研究發現UBA等位基因12個。Aoyagi等［17］的研究也證明了虹鱒UBA基因第2外顯子存在高度多態性，且變異主要發生在抗原肽結合區，這導致了個體在免疫力上存在差異。引起MHC基因多態性的動力主要是環境中的病原壓力［26，27］。

3.2 選擇壓力檢測

很多關于MHC基因序列多態性的研究都證明了MHC基因的多態性是正向選擇的結果［28，29］。非同義替換率和同義替換率的比值可以用來檢測任何一段DNA序列的平衡選擇［30］，一般認為 dN/dS＜1（P＜0.05）是受到負向選擇的作用，dN/dS=1為平衡選擇的結果，dN/dS＞1（P＜0.05）為正向選擇的作用［31，32］。參照人類HLA I類分子的三維結構，對虹鱒UBA基因的PBR位點進行了界定［33，34］，UBA基因外顯子2全序列、PBR區及Non-PBR區的dN均極顯著大于dS（P＜0.001），可以認為虹鱒UBA基因在進化過程中主要受到正向選擇的作用。此外，氨基酸含量的差異性及密碼子使用頻率的不同都說明了虹鱒UBA基因在進化過程中受到選擇壓力，導致了對密碼子使用存在偏倚性。

3.3 MHC在抗病育種中的應用

MHC作為與免疫相關的基因家族，不同等位基因具有不同的抗病能力，這已在包括魚類的很多物種中被證明［35，36］。Johnson等［7］發現虹鱒Ⅰ類b區基因在抗細菌冷水病的作用，并篩選出8個和該區基因緊密連鎖的標記，Miller等［37］將大西洋鮭對IHNV有抗性的基因位點定位在非經典的MHCⅠ類基因上，Kjglum等［6］發現大西洋鮭的Ⅰ類的UBA基因與IHNV抗病性相關，并且已利用MHC基因作為分子標記成功地篩選出了大西洋鮭抗IHNV的抗病品系。虹鱒、大西洋鮭和斑馬魚UBA等位基因間系統發生關系表明，虹鱒UBA基因與大西洋鮭UBA基因親緣關系較近，推測虹鱒UBA基因可能具有與大西洋鮭UBA基因相似的功能，有望作為虹鱒抗病育種的一個潛在遺傳標記，尤其在鮭鱒魚類易感的傳染性造血器官壞死病抗病育種中具有應用價值。

4 結論

從虹鱒UBA基因第2外顯子的序列中發現了12個等位基因，有11個為首次發現。單個個體最多存在4種等位基因，說明虹鱒UBA基因存在多拷貝位點（至少2個）。虹鱒UBA基因第2外顯子多態性豐富，且在進化過程中受到正向選擇的作用，可望作為抗病育種應用中的一個潛在遺傳標記。

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