五條蚋（Simulium quinquestriatum）不同地理種群遺傳多樣性的ISSR標記研究

修江帆 張春林 陳漢彬

五條蚋 Simulium（Simulium）quinquestriatum Shiraki，1935，隸屬于蚋科（Simuliidae）蚋屬（Simulium）蚋亞屬（Simulium）盾紋組（stiatum-group），廣泛分布于東洋界，現(xiàn)已報道的國家有中國、韓國、日本、泰國和越南等［1］。在我國幾乎全境皆有分布，已見記錄的省區(qū)有臺灣、遼寧、福建、江西、陜西、廣東、廣西、湖南、貴州、四川、云南、西藏等［2］。目前，五條蚋除吸血、騷擾人畜外，其流行病學尚不清楚，在此方面研究報道非常少見，僅見Fukudam于2008年報道五條蚋幼蟲能夠試驗感染微絲蚴（microfilariae）［3］。據(jù)觀察，五條蚋一般分布于人畜活動頻繁的地區(qū)，對生境的適應范圍廣，偏好滋生于有機質(zhì)含量豐富的水體，往往是該地區(qū)的優(yōu)勢蚋種。因此認為五條蚋的分布范圍廣，適應性強，易于采集，是研究蚋類種群演化及遺傳多樣性的良好材料。

簡單重復序列間區(qū)（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）標記技術是由加拿大蒙特利爾大學Zietkiewicz等［4］于1994年在微衛(wèi)星標記的基礎上發(fā)展起來的一種分子標記技術。該標記技術綜合了其它標記技術的多種優(yōu)點，具有操作簡單、引物開發(fā)費用低、穩(wěn)定性好、檢測多態(tài)性能力強、所需DNA模板量少、無需知道基因組序列等特點，已被成功地運用于親緣關系、遺傳多樣性、種質(zhì)鑒定和構(gòu)建遺傳圖譜等研究領域［5-9］。關于蚋類的ISSR相關研究僅見于捷克斯洛伐克Dusinsky［10］關于蚋種內(nèi)和種間的鑒定，及本課題組廉國盛［11］關于中國8亞屬23蚋種ISSR分子進化研究；而蚋類種群ISSR研究在國內(nèi)外均未見相關報道。本研究采用ISSR分子標記技術對中國8個五條蚋種地理群種的遺傳多樣性及遺傳分化進行研究分析，旨在從分子水平對五條蚋種群遺傳結(jié)構(gòu)及演化的研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用五條蚋采自貴州貴陽三江（GZSJ）、貴州青巖（GZQY）、貴州息烽（GZXF）、福建長樂（FJCL）、福建寧德（FJND）、四川夾江（SCJJ）、廣西興安（GXXA）、云南勐臘（YNML）5省8個地理種群（表1），每個種群分別取20條個體進行基因組DNA提取，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

試驗主要藥品：引物由上海生工生物工程有限公司合成；dNTP，Mg2+，Taq DNA聚合酶，Marker DL2000 DNA Ladder 購置于TaKaRa公司；BSA（牛血清白蛋白）購置于Sigma公司。

表1 用于ISSR分析的五條蚋種群

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取及定量保存 參照酚-氯仿抽提法［12］，每個種群選取20條五條蚋提取基因組DNA，8個種群共計160個DNA樣本，經(jīng)電泳檢測后，用紫外分光光度計將其濃度定量為50ng/μL，-20℃保存。

1.2.2 ISSR分析

1.2.2.1 引物的篩選 經(jīng)前期試驗優(yōu)化設計的五條蚋ISSR-PCR最佳反應體系中篩選出多態(tài)性高、穩(wěn)定性好、條帶清晰的8條引物用于PCR擴增反應（表 2）。

表2 ISSR-PCR 擴增所用引物

1.2.2.2 PCR 擴增 20μL 反應體系中引物1.0μmol/L、模板 50.0ng/μL、dNTP0.15mmol/L、Mg2+1.50mmol/L、BSA 2.00mg/mL、Taq DNA 聚合酶 0.15 5U/μL，ddH2O補齊。PCR反應在5331（德國Eppendorf）基因擴增儀中進行，PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性 50s，51℃退火 60s，72℃延伸 90s，35個循環(huán)；72℃延長10min，10℃保存［11］。PCR產(chǎn)物與1μL 6×loading buffer混勻后取 6μL，以 TaKaRa公司的DL2000 Marker為對照，用1.0％瓊脂糖凝膠（含EB0.05μg/mL），電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓200 V恒定電泳40min，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 運用Quantity One 4.2.1軟件分析ISSR擴增的譜帶，在相同遷移位置上，有譜帶存在賦值為“1”，無譜帶賦值為“0”，建立五條蚋8個種群的二元數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)導入POPGEN1.32軟件［13］，計算五條蚋不同種群的遺傳距離，Nei氏基因多樣性指數(shù)H（gene diverdity），Shannon 氏信息指數(shù) I（shannon’s information index），多態(tài)性位點比例P（percentage of polymorphic loci），同位點等位基因數(shù)A（Observedmean number of alleles per locus），同位點有效等位基因數(shù)AE（Effectivemean number of alleles per locus），遺傳分化系數(shù)（Coefficient of gene differentiation，Gst）［14］。 運 用 軟 件MEGA version 4.0［15］選擇非加權(quán)組平均法UPGMA（unweighted pair-groupmethod for arithmetic averages analysis）和鄰位聚類法NJ（Neighbor-Joining）對五條蚋8個種群進行種群聚類分析。Google earth 6.0.1軟件計算8個種群的地理距離。GenAlEx 6.41軟件對種群間和種群內(nèi)的遺傳變異進行分子方差分析AMOVA［16］（Analysis of Molecular Variance），ISSR 表型特征的主成分分析（PCA主成分分析）［17］并檢測種群間地理距離與遺傳距離的相關性。

2 結(jié)果

2.1 五條蚋種群DNA的ISSR擴增結(jié)果

篩選的8條引物對8個種群共160條五條蚋DNA進行ISSR-PCR擴增，共獲得111條有效條帶，這些條帶的大小介于200-2000bp之間（圖1），其中引物IS18擴增條帶數(shù)最多，為20條；引物IS22擴增條帶數(shù)最少，為9條，平均每條引物擴增13.88條條帶；不同引物擴增出的多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)性條帶比例有一定差異，引物IS01多態(tài)性比例最大，為93.33％；引物IS03最小，為76.47％（表3）。不同種群的每一個個體均呈現(xiàn)出為宜的ISSR基因型，這也證明ISSR標記對五條蚋具有很高的鑒別能力，同時也說明五條蚋個體之間存在較大的遺傳變異。這些位點在種群中分布不均勻。從五條蚋8個種群的多態(tài)性位點比例可看出五條蚋的遺傳多樣性較為豐富。

圖1 引物IS01對五條蚋群體的ISSR擴增電泳圖

表3 五條蚋種群ISSR擴增引物產(chǎn)生的多態(tài)性條帶

2.2 五條蚋種群的遺傳多樣性

從表4中可看出，五條蚋在物種水平上多態(tài)性位點比例為86.47％，單個種群多態(tài)性條帶比例的變化范圍從最低的種群GZQY（P=66.25％）到最高的種群GXXA（P=86.57％）。在物種水平上同位點有效等位基因AE平均數(shù)為1.553 2±0.334 5，范圍從最低的種群YNML（1.2090±0.2090）到最高的種群GZSJ（1.3811±0.398 6）。Shannon氏多樣性指數(shù)（I）物種水平為0.484 7±0.203 7變化范圍從最低的種群YNML（0.194 3±0.2591）到最高的種群GZSJ（0.314 4±0.305 5）。Nei氏遺傳距離（H）物種水平為0.3231±0.157 9，變化范圍從最低的種群YNML（0.126 4±0.178 4）到最高的種群 GZSJ（0.215 3±0.2141）。總體結(jié)果分析五條蚋物種水平的遺傳多樣性水平比單個種群的高；種群間相比較同位點有效等位基因AE數(shù)、Shannon氏多樣性指數(shù)（I）、Nei氏遺傳距離（H）所反映的變化趨勢一致（YNML＜FJCL＜GXXA＜GZQY＜GZXF＜FJND＜SCJJ＜GZSJ），但在多態(tài)性位點比例上卻有所不同（GZQY＜FJCL＜GZXF＜SCJJ＜GZSJ＜FJND＜YNML＜GXXA）。

表4 五條蚋種群間的遺傳多樣性指數(shù)

2.3 五條蚋種群的遺傳分化

用POPGENE 1.32計算出的遺傳變異分析結(jié)果（表5）表明，五條蚋種群間存在著一定的遺傳分化。8個種群總的遺傳多樣性Ht=0.3231，其中種群內(nèi)部的遺傳多樣性Hs=0.1801，種群間的基因多樣度（Dst=Ht-Hs）為0.1430，Nei的遺傳分化系數(shù)Gst=0.5900，提示有59％的遺傳分化存在于種群間，41％的遺傳分化存在于種群內(nèi)部，種群間的遺傳分化大于種群內(nèi)部的分化，種群內(nèi)部遺傳分化水平相對較低。種群間基因流［（Nm=0.5（1-Gst）/Gst）］為0.347 5，基因流較小。用AMOVA進行的基于Nei氏距離平方的遺傳變異方差分析結(jié)果也顯示五條蚋的遺傳分化主要存在于種群間，占總分化的59％，種群間的遺傳分化占41％（P＜0.001）（表6）。

表5 五條蚋種群遺傳多樣性Nei氏分析

表6 五條蚋種群遺傳分化分子方差分析（AMOVA）

2.4 遺傳距離、地理距離及聚類分析

遺傳距離可以較為直觀地反映每個種群間彼此親緣關系的遠近，為確定五條蚋8個地理種群之間的遺傳關系，對Nei氏遺傳距離進行了計算（表7）；根據(jù)采集點的地理坐標計算種群間的地理距離（表7）。五條蚋8個種群中種群GZSJ與種群GZQY之間遺傳距離最近為0.067 6，種群SCJJ和種群YNML之間遺傳距離最遠為0.3410；種群GZSJ與種群GZQY之間地理距離最近為42.31 km，種群FJND和種群YNML之間遺傳距離最遠為908.21 km。

基于種群間Nei氏遺傳距離，運用NJ法和UPGMA法對五條蚋8個種群進行聚類分析。結(jié)果（圖2，圖3）顯示，五條蚋8個種群分化成為2個大組4個亞組，其中種群GZSJ、GZQY、GZXF、SCJJ組成了第1大組，種群FJCL、FJND、GXXA、YNML組成了第2大組。在第1組中，種群GZSJ、GZQY首先聚集形成1支，后又與種群GZXF聚集形成第1亞組，種群SCJJ單獨形成第2亞組；在第2大組中，種群FJCL、FJND匯聚組成第3亞組，種群GXXA、YNML聚集行成第4亞組。NJ法和UPGMA法聚類分析結(jié)果基本一致。PCA主成分分析結(jié)果顯示（圖4），PCA軸1將第一組的4個種群（種群GZSJ、GZQY、GZXF、SCJJ）與第二組的4個種群（種群FJCL、FJND、GXXA、YNML）進行分隔，PCA軸2將第一組中種群GZSJ和種群GZQY聚成一分支，將第二組中的種群FJCL和種群FJND聚成另一分支，種群GZXF單獨聚為一支；PCA的軸3將第一組中種群SCJJ單獨分隔出來成為一亞組，同時將第二組中種群GXXA與種群YNML進行分隔。PCA分析結(jié)果支持NJ法及UPGMA法聚類結(jié)果。

圖2 基于Nei氏遺傳距離做出的五條蚋種群的NJ聚類分析圖

圖3 基于Nei氏遺傳距離做出的五條蚋種群的UPGMA聚類分析圖

圖4 基于ISSR表型特征的主成分分析（PCA）

圖5 五條蚋種群遺傳距離與地理距離的回歸分析

將五條蚋8個種群間的遺傳距離以及地理距離進行相關性的檢驗（mantel test）（圖5），建立回歸方程為y = 7E-05x +0.164 2，相關性系數(shù)| r | =0.510 7（P=0.01＜0.05）。結(jié)果說明五條蚋各種群間的遺傳距離與地理距離間呈現(xiàn)正相關，種群間的基因交流可能被它們之間的地理距離所限制。

3 討論

3.1 五條蚋的遺傳多樣性

多態(tài)位點比例（P），Shannon氏多樣性指數(shù)（I），Nei氏基因多樣性指數(shù)（H），同位點上等位基因數(shù)（A）及同位點上有效等位基因數(shù)（AE）是衡量種群多樣性的常用指標［18］。遺傳多樣性是物種或居群長期進化的產(chǎn)物，也是其生存發(fā)展和進化的基礎［19］。一個物種或種群遺傳多樣性水平越高則說明其對環(huán)境變化的適應能力越強。研究對五條蚋8個種群的結(jié)果顯示，五條蚋物種遺傳多樣性水平（AE=1.553 2±0.334 5，H=0.3231±0.157 9，I=0.484 7±0.203 7）較其它昆蟲高，如角倍蚜（AE=1.403±0.338，H=0.247±0.169，I=0.387±0.221）［20］；桃蛀螟（AE=1.249 7±0.238 4，H=0.1750±0.1331，I=0.296 6±0.185 5）［21］，可說明五條蚋豐富的遺傳多樣性證實其對環(huán)境變化具有較強適應抵抗力的遺傳基礎，這也解釋了五條蚋廣泛分布于東洋界，在我國幾乎全境皆有分布的原因；同時研究發(fā)現(xiàn)五條蚋物種遺傳多樣性水平比單個種群的高，是因其分布廣泛，滋生生境復雜，決定其豐富的遺傳多樣性。

3.2 五條蚋的遺傳分化

生物種群遺傳分化主要決定于種群內(nèi)遺傳漂變與種群間基因流兩者的動態(tài)平衡。Wright 等［22］提出的遺傳分化理論認為：當遺傳分化系數(shù)（Gst）的值介于0-0.05之間表示種群間遺傳分化程度低；0.05-0.15為分化程度中等；0.15-0.25為分化程度高；大于0.25表明種群遺傳分化程度極大。本研究結(jié)果顯示，五條蚋8個種群間的Gst=0.5900，種群分化程度極大；依據(jù)分子方差（AMOVA）分析結(jié)果，五條蚋種群間分化占遺傳分化59％，種群內(nèi)部分化占遺傳分化41％，說明五條蚋的遺傳分化發(fā)生在種群之間，而種群內(nèi)部遺傳分化相對較低，處于次要地位。究其原因：（1）由于地理隔離，導致種群中的遺傳漂變，增加了種群的遺傳多樣性。本研究的五條蚋種群分別采自貴州、云南、四川、廣西、福建5省的8個不同采集點，采集點之間最近相距42.31 km，最遠相距1 908.21 km。地理位置經(jīng)度跨越約18（E：101 34'- E：119 31'）；緯度跨越約8（N：2128'-N：29 44'）；海拔 高度差距約1100m（19-1120m）；地形有平原、丘陵、盆地和高原。由于采集點之間的地理距離跨度大、地形地貌多樣，可能由于天然地理屏障存在，導致五條蚋的種群間的遺傳分化水平較高。（2）基因流的影響。通常物種基因流的水平高，物種遺傳分化小；基因流的水平低，則物種遺傳分化大。依據(jù)群體遺傳學理論［23］，當基因流Nm＜1時，就不足以抵制居群內(nèi)因遺傳漂變而引起的居群間遺傳分化；當基因流Nm＞4時，表明種群間的基因交流比較充分，足以抵制遺傳漂變的作用，消弱了種群間遺傳分化的產(chǎn)生。五條蚋的Nm=0.347 5＜1，說明種群間的基因交流不充分，遺傳漂變的作用較強，可能導致種群間遺傳分化的產(chǎn)生。同時，本研究對種群間的遺傳距離與地理距離的相關性分析，表明8個種群間的遺傳距離在0.126 4-0.215 3之間，距離較大，且種群間的遺傳距離與地理距離呈正相關，地理距離間隔越遠，遺傳距離差距越大。也進一步說明五條蚋種群由于受到地理屏障的制約，不能進行充分的基因交流，種群間基因流水平不高。

3.3 五條蚋種群的聚類分析

本研究基于Nei氏遺傳距離，分別運用NJ法、UPGMA法和PCA主成分分析法對五條蚋8個種群進行聚類分析。3種聚類分析法顯示的結(jié)果均保持一致，表明了聚類分析的結(jié)果可靠性較高。聚類分析的結(jié)果表明，五條蚋8個種群的遺傳距離與它們的地理間隔距離具有一致性。貴州與四川的種群聚成一支，而福建、廣西、云南的種群聚成一支，分別表明貴州與四川的種群之間遺傳距離較近；福建、廣西、云南的種群之間的遺傳距離較近，基因流水平較高，可能代表五條蚋在這些地區(qū)的擴散模式。目前認為蚋類的擴散主要有兩種方式：成蟲的遷飛和幼蟲隨流遷移。據(jù)相關研究報道［24］，蚋成蟲的遷飛距離變化較大，如Simulium neavei最大遷飛距離＜4 km，而Simulium damnosum及Simulium sirbanum最大遷飛距離可達到400 km。成蟲的遷飛可能是蚋類擴散主要方式，與風向、風力有關，而幼蟲隨流遷移則與水系分布，流速等有關。

4 結(jié)論

構(gòu)建了中國五條蚋8個種群160個體的ISSR指紋圖譜，每個種群均顯示出獨特的圖譜特征。

五條蚋在物種水平遺傳多樣性較高；在種群水平遺傳多樣性較低，五條蚋豐富的遺傳多樣性證實其對環(huán)境變化具有較強適應能力。

五條蚋遺傳分化主要發(fā)生在種群之間，地理屏障（高山和平原等）以及棲息地片段化是導致其遺傳分化形成的主要因素。

［1］ Adler PH, Crosskey RW.World Blackflies（Diptera：Simuliidae）：A Comprehensive Revision of the Taxonomic and Geographical Inventory ［2010］.http：//entweb.clemson.edu/biomia/pdfs/blackflyinventory.pdf

［2］ 陳漢彬, 安繼堯.中國黑蠅（雙翅目：蚋科）［M］.北京：科學出版社, 2003：258-259.

［3］ Fukuda M, Takaoka H, Uni S, et al.Infective Larve of five Onchocerca species from experimentally infected Simulium species in an area of Zoontic Onchocerciasis in Janpan ［J］.Parasite, 2008, 15（2）：111-119.

［4］ Zietkiewicz E, Rafslski A, Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）anchored polymerasechain re-action amplification ［J］.Genomics, 1994, 20：176-183.

［5］ 周延清.DNA分子標記技術在植物研究中的應用［M］.北京：化工工業(yè)出版社, 2005：68-70.

［6］ Agostini G, Echeverrigaray S, Souza-Chies TT.Geneticrela-tionships among South American species of Cunila D.Royen ex L.based on ISSR ［J］.Plant Syst Evol, 2008, 274：135-141.

［7］ Dje Y, Tahi CG, Bi AI, et al.Use of ISSRmarkers to assess genetic diversityof African edibleseeded Citrullus lanatus landraces ［J］.Scientia Horticulturae, 2010, 124（2）：159-164.

［8］ Du XY, Zhang QL, Luo ZR.Development of retrotransposon primers and their utilization for germplasm identification in Diospyros spp.（Ebenaceae）［J］.Tree Genetics ＆ Genomes, 2009, 5：235-245.

［9］ Gupta S, Pandey-Rai S, Srivastava S, et al.Construction of genetic linkagemap of themedicinal and ornamental plant Catharanthus roseus ［J］.Journal of Genetics, 2007, 86（3）：259-268.

［10］ Dusinsky R, Kudela M, Stloukalova V, et al.Use of inter-simple sequence respeat（ISSR）markers for discrimination between and within species of blackflies（Diptera：Simuliidae）［J］.Section Cellular and Molecular Biology Biologia, 2006, 61（3）：299-304.

［11］ 廉國盛.山西蚋類區(qū)系研究和中國8亞屬23蚋種ISSR分子進化研究［D］.貴陽：貴陽醫(yī)學院，2009.

［12］ 范海榮, 夏永靜.四種全血基因組DNA提取方法的比較［J］.中國動脈硬化雜志, 2002, 10（6）：535-536.

［13］ Yeh FC, Yang RC, Boyle T, et al.POPGENE, the user friendly shareware for population genetic analysis ［M］.Edmonton：University of Alberta, 1997.

［14］ Nei M, Li WH.Mathematicalmodel for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases ［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1979, 76（10）：5269-5273.

［15］ Kumar S, Tamura K, Jakobsen IB, et al.MEGA2：Molecular evoutionary genetics analysis software ［J］.Bioinformatics, 2001,17（12）：1244-1245.

［16］ 陳俊秋, 慈秀芹.樟科瀕危植物思茅木姜子遺傳多樣性的ISSR分析［J］.生物多樣性, 2006, 14（5）：410-420.

［17］ 王曉明, 賴燕玲.深圳梅林仙湖蘇鐵野生種群遺傳多樣性ISSR分析［J］.中山大學學報：自然科學版, 2006, 45（3）：82-85.

［18］ 朱勛, 楊家強.小菜蛾不同地理種群遺傳多樣性的ISSR標記研究［J］.昆蟲學報, 2012, 55（8）：981-987.

［19］ 陳靈芝.中國的生物多樣性—現(xiàn)狀及其保護對策［M］.北京：科學出版社, 1993：11-15.

［20］ 王定江, 楊漢遠, 鐘揚, 任竹梅.貴州省八個種群角倍蚜ISSR遺傳多樣性［J］.生態(tài)學雜志, 2008, 27（10）：1729-1733.

［21］ 張穎, 李菁, 王振營.中國桃蛀螟不同地理種群的遺傳多樣性,昆蟲學報, 2010, 53（9）：1022-1029.

［22］ Wright S.Evolution and the genetics of populations.//Variability within and among natural populations ［M］.Chicago：University of Chicago Press, 1978.

［23］ Slatkin M.Gene flow in natural populations ［J］.Annual Review of Ecology ＆ Systematics, 1985（16）：393-430.

［24］ Peter H, Adler A.Evolution, epidemiology, and population genetics of black flies（Diptera：Simuliidae）［J］.Genetics and Evolution, 2010（10）：846-865.