三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）Perlucin蛋白原核表達條件的優化及表達產物的鑒定

林靜云 白志毅 李家樂

三角帆蚌（Hypriosis cumingii）隸屬雙殼綱（Bivalvia）、蚌科（Unionidae）、帆蚌屬（Hypriosis），是我國重要的淡水育珠蚌，主要分布于洞庭湖、太湖和鄱陽湖等大中型湖泊及其流域中［1］。自1979年人工繁殖成功，三角帆蚌已成為我國最重要的經濟淡水珍珠蚌［2］。目前我國淡水珍珠年產量達1 800多噸，占世界淡水珍珠總產量的95％以上，占我國珍珠總產量的98％以上［3］，其中超過90％的淡水珍珠產自于三角帆蚌［4］，但產值僅占世界10％。這種產量與產值強烈反差的現象主要是由我國珍珠質量不高所致［5］，從而嚴重制約了產業的健康發展。因此尋找提高珍珠質量的新措施，尤其是運用生物學技術手段，是珍珠產業發展的迫切需求。而建立提高珍珠質量的新的生物學措施則必須闡明珍珠的形成機理，目前對于珍珠形成機理的研究主要集中在貝殼上，這是因為貝殼和珍珠在微觀結構和化學組成上被認為是相同的物質［6］。

貝殼由大約95％的文石和5％的有機大分子復合而成，其中有機大分子包括基質蛋白和其他的一些生物高聚物［7］?；|蛋白雖然所占組分很少，但它不僅能夠參與有機珍珠層框架的構建，決定碳酸鈣晶體的多型構象，還控制著文石晶體的成核與生長［8，9］?；|蛋白在外套膜中的表達與其在貝殼中的分布相對應，具有區域化的特點。外套膜邊緣分泌的基質蛋白參與了棱柱層的形成，為棱柱層基質蛋白；外套膜中央分泌的基質蛋白主要參與珍珠層的形成，為珍珠層基質蛋白。根據基質蛋白在貝殼中的分布和外套膜中表達的區域性的特點，可以明確所發現的基質蛋白的分類和功能。例如，MSI60在外套膜中部特異性地表達，是貝殼珍珠層基質蛋白，參與珍珠層的形成；MSI31特異性地表達在外套膜的邊緣，是棱柱層基質蛋白，參與棱柱層的形成［10］；nacrein基因在外套膜的中部與邊緣均有表達，屬于兩者共有的基質蛋白［11］。

Perlucin基質蛋白是從鮑的珍珠層中最先分離得到的，屬于珍珠層基質蛋白，具有提高碳酸鈣晶體形成速度，修飾晶體形態等功能。它不僅是珍珠層的組成部分，也是對貝殼和珍珠的形成具有重要功能的大分子［12，13］。然而在淡水珍珠蚌中對于perlucin基因的研究卻未見報道，為了進一步了解Perlucin蛋白對珍珠形成的作用，本試驗構建Perlucin蛋白原核表達質粒，優化該表達質粒的誘導條件，并通過Western blot技術進行鑒定。以期為進一步研究三角帆蚌Perlucin蛋白的生理功能、結構特點和作用原理提供基礎理論。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌（Escherichia coli）感受態細胞DH5α、BL21（DE3）、異丙基 -β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和硫酸卡納霉素購自上海天根生化科技公司。限制性核酸內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和T4 DNA連接酶購自NEB公司。NC膜購自Bio-Rad公司。鼠抗Histag單抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG及DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。pMD19-T Vector與其他常規生化試劑均購自大連寶生物工程有限公司。原核表達載體pET-28a為本實驗室保存。PCR引物均由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 perlucin基因ORF的克隆及重組表達質粒pET-28a-Hcperlucin的構建 根據本實驗室已克隆得到的三角帆蚌perlucin基因全長cDNA序列（GenBank登錄號：KC436008），利用Primer Premier 5軟件設計一對特異性引物。其中上游引物PerF為：5'-CGGGATCCATGGATTTCTCATTGATATTCGT-3'（下劃線為BamHⅠ酶切位點），下游引物PerR為：5'-CGCGAATTCCTAAGACCGTGCCTGACAGAT-3'（下劃線為EcoRⅠ酶切位點，斜體為終止密碼子）。以三角帆蚌cDNA第一條鏈為模板，用包含酶切位點的特異性引物PerF、PerR擴增三角帆蚌perlucin基因ORF的全長。PCR反應條件為：94℃預變性3min；94℃ 30s，59℃ 1min，72℃ 1min，共 30 個循環；最后72℃延伸10min。PCR產物純化后連接到pMD19-T Vector后轉化E.coli感受態細胞DH5α，搖菌提取質粒，用限制性酶BamHⅠ和 EcoRⅠ分別雙酶切處理帶有目的片段的pMD19-T和pET-28a。酶切片段與線性化質粒pET-28a連接并轉化E.coli感受態細胞BL21（DE3）。使用菌落PCR篩選陽性克隆，進一步通過雙酶切鑒定。同時將陽性克隆測序鑒定，以確定插入序列正確。

1.2.2 細菌培養及重組蛋白表達 將經過鑒定過的工程菌接種于4mL LB液體培養基（含硫酸卡那霉素50μg/mL）中，37℃振蕩培養過夜。按1∶50的比例擴大培養，至OD600介于0.4-0.6，加入終濃度1mmol/L IPTG 37℃誘導表達4h，取20mL菌液離心收集菌體，超聲破碎，離心后取上清，沉淀用8mol/L的尿素溶解，以SDS-PAGE（濃縮膠濃度 50mg/mL，分離膠濃度12mg/mL）分析重組蛋白表達情況。同時設置未誘導的工程菌作為陰性對照。

1.2.3 最佳誘導溫度試驗 取過夜培養的轉化菌液BL21按1∶50的比例擴大培養，至OD600介于0.4-0.6，加入終濃度為1mmol/L IPTG誘導表達。在30℃、37℃和42℃條件下誘導4h后各取20mL菌液離心收集菌體，超聲破碎，對離心后的沉淀以SDS-PAGE分析目的蛋白表達的最佳溫度條件。

1.2.4 最佳誘導時間試驗 細菌培養方法同上，當OD600介于0.4-0.6時，在“1.2.3”確定的目的蛋白表達的最佳溫度條件下加入終濃度為1mmol/L IPTG，分別于誘導0、2、4、6、8、10和12h后各取20mL菌液，以SDS-PAGE分析目的蛋白的表達量，確定目的蛋白表達的最佳誘導時間。

1.2.5 最佳誘導劑濃度試驗 細菌培養方法同上，在“1.2.3”和“1.2.4”確定的最佳誘導溫度和誘導時間條件下，加入不同濃度的IPTG，使其終濃度分別為0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、1.5和2.0mmol/L 7個濃度梯度，以SDS-PAGE分析目的蛋白的表達量，確定目的蛋白表達的最佳IPTG誘導濃度。

1.2.6 Western blot分析鑒定 重組融合蛋白經SDSPAGE電泳后轉至NC膜上。NC膜浸泡于封閉液中于室溫放置1h后，用鼠抗His-tag單抗與之于4℃條件下反應過夜，二抗為辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG，各步驟之間用含體積分數0.1％的Tween-20的磷酸緩沖液（TTBS）洗膜4次，每次10min，最后用二氨基聯苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）顯色液顯色至有清晰的目的條帶出現并拍照。

2 結果

2.1 perlucin基因原核表達載體的構建與鑒定

PCR擴增到約483bp的基因片段。將回收純化的目的片段轉入pMD19-T Vector后，構建pMD-19T-Hcperlucin重組質粒，對該質粒進行BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，將酶切產物中的目的片段與表達載體pET-28a連接，并轉化至大腸桿菌BL21感受態細胞，構建pET-28a-Hcperlucin重組表達質粒，菌落PCR擴增出與預期結果483bp大小一致的特異性條帶（圖1-A）。對該重組表達質粒進行雙酶切鑒定，也得到一條長約483bp的條帶（圖1-B），與預期大小一致。對酶切鑒定正確的陽性克隆進行測序，序列比對結果正確，表明原核表達載體pET-28a-Hcperlucin已構建成功。

圖1 重組質粒 pET-28a-Hcperlucin菌液PCR鑒定（A）及雙酶切鑒定（B）

2.2 三角帆蚌perlucin重組融合蛋白在大腸桿菌中的表達及表達條件優化

2.2.1 重組融合蛋白表達 收集的工程菌經超聲破碎，分離上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳分析。

與未經誘導的工程菌相比，經過IPTG誘導后，菌體蛋白沉淀泳道處多出1條明顯條帶，其大小與預測的重組蛋白分子量相近，約21kD，而上清泳道則無相應的條帶（圖2），表明重組融合蛋白主要以包涵體形式存在。

圖2 pET-28a-Hcperlucin重組蛋白的表達分析

2.2.2 最佳誘導溫度 在其他條件一致的情況下，不同誘導溫度下重組融合蛋白的表達量的結果（圖3）表明，37℃條件下蛋白表達量明顯高于42℃下的表達量，而30℃條件下的表達量很低。所以該重組融合蛋白的最佳誘導溫度是37℃，并且以包涵體形式表達。

2.2.3 最佳誘導時間 誘導時間是影響重組融合蛋白表達量的重要因素之一，在其他條件一致的情況下，經不同時間（0-12h）誘導后，誘導時間在6h以內，重組融合蛋白的表達量隨著時間的延長而增高，但是隨著誘導時間的延長，重組融合蛋白表達量呈現下降趨勢（圖4）。這表明長時間誘導不但不能提高重組蛋白表達量，還使表達量下降，故該重組融合蛋白的最佳誘導時間是6h。

圖3 不同溫度誘導表達的SDS-PAGE分析

圖4 不同時間誘導表達的SDS-PAGE分析

2.2.4 最佳誘導濃度 在其他條件一致的情況下，不同濃度的IPTG（0.1-2.0mmol/L）均可明顯誘導重組融合蛋白的表達。濃度在0.1-1.0mmol/L的IPTG誘導的重組融合蛋白表達量變化不大，但在1.5mmol/L和2.0mmol/L的濃度下，表達量明顯下降（圖5）。由于高濃度IPTG不利于細菌生長，因此該重組融合蛋白的IPTG最佳誘導濃度是0.1mmol/L。

2.3 重組融合蛋白的Western blot鑒定

在優化的表達條件下，對重組融合蛋白進行Western blot分析（圖6）顯示，重組融合蛋白可與His-tag單克隆抗體結合，表現出與重組融合蛋白大小一致的條帶，結合pET-28a-perlucin 質粒的測序結果可推斷，已成功表達三角帆蚌Perlucin蛋白。

圖5 不同IPTG濃度誘導表達的SDS-PAGE分析

圖6 用His-tag單克隆抗體進行Western blot分析

3 討論

由于大腸桿菌具有易于培養、繁殖快、表達量高、成本低、易純化、遺傳背景清楚等優點，因此以大腸桿菌為載體的原核表達系統目前被廣泛采用，成為高效表達研究的首選體系，其中BL21是應用最廣的宿主菌［14］。pET-28a載體的N、C端帶有Histag，有利于表達蛋白純化和鑒定，且不影響重組融合蛋白的結構和功能，是抗原蛋白表達常用載體。因此本研究選用pET-28a為原核表達載體，將三角帆蚌perlucin基因的ORF序列連接到載體上，導入大腸桿菌BL21中，成功獲得pET-28a-Hcperlucin重組質粒，并通過對誘導溫度、誘導時間和誘導劑濃度的優化，提高了蛋白的表達量。同時根據載體上的6個His標記，通過與His-tag單克隆抗體結合進行Western blot鑒定蛋白，確認所得蛋白為目的蛋白。

試驗結果表明，重組融合蛋白在37℃、誘導6h、IPTG濃度為0.1mmol/L的條件下能大量表達目的蛋白，但主要以包涵體的形式存在。重組大腸桿菌在30℃時為最適表達溫度，37℃為最適的細菌生長溫度［15］。然而，在本試驗中，重組蛋白在30℃的時候表達產物量遠遠低于37℃，而盤鮑中該重組蛋白在37℃同樣能夠得到較好的表達［16］，這說明重組蛋白最佳誘導溫度可能受到插入目的基因的影響。誘導劑IPTG 會阻遏蛋白不能與操縱基因結合，使外源基因大量表達，但高濃度的 IPTG 誘導會阻礙蛋白的表達［17］。本試驗的誘導結果同時說明長時間的誘導并不能進一步提高蛋白的表達量。而IPTG的濃度在1.0mmol/L的范圍內也不會對重組融合蛋白表達產生較大影響。IPTG雖然對細胞沒有毒害作用，但可以通過改變培養基的酸堿度，從而抑制細菌生長［18］。因此，在表達量相差不大的情況下，應選用濃度較低的IPTG進行誘導。Western blot結果顯示，重組融合蛋白pET-28a-Hcperlucin可與鼠抗Histag單抗特異性結合，說明本研究獲得了pET-28a-Hcperlucin表達產物。這為抗體制備、體外結晶試驗、進一步探究Perlucin蛋白的生理功能、結構特點和作用原理提供了研究基礎。

4 結論

將三角帆蚌perlucin基因序列連接到表達載體pET-28a中，IPTG誘導重組融合蛋白pET-28a-Hcperlucin在大腸桿菌中表達。重組融合蛋白pET-28a-Hcperlucin的最優表達條件為37℃、誘導6h、IPTG濃度為0.1mmol/L。通過與鼠抗His-tag單克隆抗體結合進行Western blot鑒定，確認所得為目的蛋白。

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