心肌梗死模型大鼠心肌組織基因表達變化及縫隙連接相關基因分析1）

吳愛明，翟建英，張冬梅，婁利霞，朱海燕，趙明鏡，王碩仁

心肌梗死（MI）是威脅人類健康的主要疾病之一[1]，在我國發病率呈現逐年升高趨勢[2]。雖然隨著MI后再灌注治療的普及，患者早期死亡率大幅降低[3]，但是幸存的MI患者仍具有發生致死性心律失常的潛在風險[4]。這與基因的改變和調控密不可分。因此，有必要從基因水平研究MI后心律失常的發生機制，以進一步降低MI患者的猝死率。本研究制作MI大鼠模型，進行了左心室心肌組織的全基因組表達譜芯片檢測和分析，并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（Real－time PCR）方法驗證了心肌細胞間縫隙連接通路相關的3條基因，旨在為進一步從基因水平認識MI后心律失常發生的分子機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠，平均體重220g～250g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證編號：SCXK（京）2002－0003。

1.2 主要儀器 RSP1002型呼吸機（美國Kent公司），心電示波儀（上海醫學電子儀器廠），雜交爐（美國Agilent公司），掃描儀（美國 Agilent公司），分光光度計（美國Nanodrop公司），Realtime PCR儀（美國Stratagene公司）。

1.3 主要試劑 RNA提取試劑盒（美國Promega公司），RT試劑盒（美國Promega公司），SYBER Green染料（美國ABI公司）。Agilent大鼠全基因組表達譜芯片（生物芯片上海國家工程研究中心）。

1.4 動物模型制備與分組方法 大鼠隨機分為模型組和假手術組，參照文獻[5]制作 MI大鼠模型，用戊巴比妥鈉（50mg／kg）麻醉，固定備皮，氣管插管，連呼吸機和心電圖儀。在左胸第三、四肋間開胸約1.5cm，用眼科彎鑷輕提左心耳，在動脈圓錐與左心耳之間下約1mm處用5／0手術線結扎左冠狀動脈前降支，迅速關胸縫合。心電圖Ⅱ導聯顯示ST段顯著抬高表示結扎成功。假手術組只穿線，不結扎。術后常規飼養1個月取材。

1.5 心肌組織的基因芯片檢測和生物學信息分析方法 由生物芯片上海國家工程研究中心完成。首先提取心肌組織樣本的總RNA，質檢合格后進行總RNA純化，cDNA合成，cRNA合成，cRNA純化，cRNA單熒光染料（Cy3）標記，芯片雜交、洗滌、掃描，歸一化處理等一系列步驟，得到基因芯片檢測結果。然后對模型組和假手術組的芯片數據進行差異基因分析，根據基因在兩個分組中幾何平均數的比值倍數決定差異基因的變化方向，比值大于1的基因為上調基因，小于1的是下調基因。用Fold Change值表示兩組數據均一化以后的信號值的差異倍數。差異基因篩選標準為Fold Change值≥2或≤0.5。在此基礎上利用京都基因與基因組百科全書（The Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）細胞通路（pathway）數據庫進行差異基因的pathway注釋，對差異基因富集的pathway進行歸類，初步分析MI后pathway的變化。

1.6 心肌組織縫隙連接蛋白43（Cx43）、蛋白激酶C（PKC）、酪蛋白激酶1（CK1）的mRNA檢測方法 登陸GenBank檢索基因序列，用Primer Premier 5軟件進行引物設計。Cx43上游引物：5′－TTCATGCTGGTGGTGTCC－3′；下游引物：5′－AGTGGTGGCGTGGTAAGG－3′。CK1 上游引物：5′－TACCGCCAACCGACTCCGAAGT－3′ ；下游引物：5′－GCGCACCTCTGTGGAGTCTCAT－3′。PKC 上游引物：5′－GCTTCAACATCGACATGCCTCACC－3′；下游引物：5′－ACATTCATGCCGCAGTCTTCACACT－3′。內 參 基 因 β－Actin 上游引物：5′－AGATCCTGACCGAGCGTGGC－3′；下游引物：5′－CCAGGGAGGAAGAGGATGCG－3′。提取左心室梗死邊緣區心肌組織總RNA，M－MLV逆轉錄酶反轉成cDNA，加入SYBR Green PCR Master Mix組成251反應體系，每個樣本做3個平行管，進行Real－time PCR檢測。擴增條件均為：95℃10min變性后；95℃30s，55℃30s，72℃20s，共40個循環。以β－Actin作為內參，將所得Ct值按照2（－ΔΔct）的方法計算mRNA的相對表達量，以差異倍數進行統計分析。

2 結 果

2.1 RNA純度和完整性檢測結果（見表1） 總RNA經分光光度計檢測，OD260nm／OD280nm，比值介于1.8～2.1；經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，28S、18S兩條帶清晰可見，且無拖尾現象，提示完整性良好，可以進行基因表達譜芯片檢測。

表1 RNA抽提檢測結果

2.2 基因芯片檢測和生物學信息分析結果 Agilent大鼠全基因組表達譜芯片采用Cy3單色熒光標記，芯片涵蓋了41 012個大鼠基因。按照差異表達基因篩選標準，與假手術組比較，模型組共篩選出上調表達的基因3 136條，下調表達的基因2 222條。pathway富集度分析顯示，這些差異基因共涉及了130個pathway。對檢索到的pathway進行初步歸類，主要涉及了糖、脂、核酸、氨基酸、能量等新陳代謝pathway；基因轉錄、蛋白水解、修飾等遺傳信息處理pathway；膜轉運、信號轉導、信號分子等環境信息處理pathway；還有運輸分解、細胞的運動、生長、死亡以及細胞間通訊等細胞過程pathway。其中與MI后心律失常發生關系比較密切的是細胞通信pathway，并且其重要分支縫隙連接pathway中的關鍵蛋白Cx43及其上游激酶CK1和PKC的基因表達出現了顯著的下調和上調。

2.3 MI大鼠心肌組織Cx43、PKC、CK1mRNA檢測結果 采用Real－time PCR檢測相關基因表達，與假手術組比較，模型組Cx43和CK1mRNA表達顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），PKC mRNA表達顯著增加（P＜0.05）。詳見表2。

表2 MI大鼠心肌組織Cx43、CK1、PKC mRNA表達的比較（±s）

表2 MI大鼠心肌組織Cx43、CK1、PKC mRNA表達的比較（±s）

組別 n Cx43mRNA CK1mRNA PKC mRNA假手術組7 1.02±0.21 1.00±0.07 1.03±0.23模型組 6 0.54±0.35 0.78±0.16 1.35±0.23 P＜0.05 ＜0.01 ＜0.05

2.4 MI大鼠心肌組織Cx43與CK1、PKC mRNA表達的相關分析結果 經Pearson相關分析，MI大鼠心肌組織Cx43mRNA表達與CK1mRNA呈顯著正相關（P＜0.01），與PKC mRNA呈顯著負相關（P＜0.05）。詳見表3。

表3 MI大鼠心肌組織Cx43與CK1、PKC mRNA表達的相關分析

3 討 論

基因芯片技術是指通過微陣（Microarray）技術將高密度的DNA片段附著在固相表面，以同位素或熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量基因表達測試，具有高通量的特點[6]。基因芯片實驗技術包括基因表達測試——生物信息學分析——驗證實驗三部分，本研究嚴格遵循了這些技術要求?；虮磉_測試采用了比較成熟的Agilent大鼠全基因組表達譜芯片，然后借助KEGG pathway數據庫對芯片數據進行了初步的生物信息學的分析，最后用Real－time PCR技術進行了感興趣基因的驗證。

本研究結果提示，MI后心臟基因表達發生了復雜的變化，出現了上千條基因的上調和下調，初步歸類這些差異基因發現涉及的pathway主要包括：糖、脂、氨基酸、能量等眾多代謝過程，并且基因轉錄、蛋白水解、修飾、膜轉運、信號轉導等遺傳信息和環境信息的處理也都表現出一定差異。此外，在細胞的運動、生長、死亡和細胞間通訊等細胞過程的pathway同樣出現了基因異常表達。其中與MI后心律失常發生關系比較密切的是細胞通信pathway。細胞通信是細胞間精確和高效的發送與接收信息的通訊機制。細胞通信pathway包括多種方式，就心室肌組織而言，縫隙連接pathway是其重要分支，由Cx43構成的心肌縫隙連接對心電活動影響巨大，它是維持心臟電活動協調性和同步性的重要結構基礎之一[7]。Cx43的異常將導致心室肌細胞電活動的整體性異常，從而使傳導的速度和傳導的各向異性發生改變，引起折返和傳導阻滯[8，9]，最終誘發惡性心律失常而危及患者生命。在縫隙連接pathway中Cx43受多種因素調節，本研究的基因芯片和熒光定量PCR驗證結果均表明，MI后Cx43的上游調節因子中CK1和PKC mRNA的異常表達明顯，可能共同導致了Cx43mRNA表達的下調。相關分析證實了這一推測，CK 1對Cx 4 3的基因表達有正調節作用（r＝0.765，P＜0.01），PKC對Cx43的基因表達有負面影響（r＝－0.645，P＜0.05）。CK1與Cx43的正相關關系可能與CK1促進縫隙連接通道的裝配有關[10]。而PKC則是通過調節Cx43的磷酸化而下調了Cx43介導的心肌細胞間通訊[11]。上述研究結果，對于從基因水平闡明MI的病理變化具有積極意義，特別是心肌細胞間縫隙連接通路的Cx43及其上游CK1和PKC mRNA的變化規律，將為深化對MI后心律失常的發病機制的認識和從基因水平防治心律失常發生提供實驗依據。

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