PI3K－Akt－eNOS信號轉導通路在丙泊酚減輕缺氧／復氧損傷致乳鼠心肌細胞凋亡中的作用1）

王建剛，田首元，凡浙錄

丙泊酚是常用靜脈麻醉藥，已廣泛用于心血管手術麻醉[1]。既往研究表明，丙泊酚能夠抑制心肌細胞凋亡而發揮心肌保護作用[2]。但其機制尚有待進一步明確。磷脂酰肌醇－3－激酶／絲氨酸－蘇氨酸激酶／內皮型一氧化氮合酶（PI3K－Akt－eNOS）信號轉導通路的激活參與介導缺血預處理減輕心肌缺血再灌注損傷的的作用[3]。丙泊酚的心肌細胞保護機制是否與PI3K－AkteNOS信號轉導通路有關尚有待研究。本研究擬評估PI3KAkt－eNOS信號轉導通路在丙泊酚減輕缺氧／復氧致乳鼠心肌細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 原代心肌細胞培養 取出生1d～3dWistar乳鼠，雌雄不限（山西醫科大學動物中心提供），75%酒精浸泡后，無菌條件下取其心臟置于預先盛有D－Hanks液的無菌平皿內，用含抗生素的D－Hanks灌沖洗兩遍。取心室肌剪碎至1mm3～2 mm3大小的組織塊，移入5 0mL離心管中，用適量預溫的0.125%胰蛋白酶和0.01%EDTA 37℃水浴震蕩分次消化，每次約8min，直至組織塊完全消化。收集除第一次以外的單細胞懸液，放入含有10%胎牛血清的DMEM培養液中，終止消化7目篩網過濾去除未消化的組織，在4℃時以1 000 r／min離心10min，棄上清，收集沉淀，加入培養液（80%DMEM、20% 胎牛血清、青霉素100U／mL、鏈霉素100U／mL和0.1mmol／L BrDU）混懸。臺盼藍染色計數，調整細胞數至5×106／L。接種到25mL培養瓶中，置37℃培養箱（含95%空氣＋5%CO2）中培養2h以純化心肌細胞（差速貼壁法）。接種到24孔培養板中，每24h觀察細胞貼壁及生長情況，并更換培養液。其中BrDU在細胞培養36h內加入以抑制非心肌細胞增殖。接種3d～4d后，用無血清的DMEM培養24h，使細胞周期同步化后行缺氧／復氧干預。

1.2 心肌細胞缺氧／復氧損傷模型建立及實驗分組 取上述原代培養6d～8d的整孔搏動的6組心肌細胞（每組10孔）。隨機分為4組，參照Koyama[4]制備缺氧／復氧模型，并分為4組。Ⅰ組（對照組）：持續通以95%O2、5%CO2、37℃溫育60min。Ⅱ組（單純純氧／復氧組）：持續通以95%N2、5%CO2、37℃溫育40min，再持續通以95%O2、5%CO2、37℃溫育20min。Ⅲ組（缺氧／復氧＋丙泊酚組）：持續通以95%N2、5%CO2、37℃溫育40min，再持續通以95%O2、5%CO2、37℃溫育20min；缺氧同時給予丙泊酚（批號：P023398，AstraZeneca公司，意大利）50 μmol／L。Ⅳ組（缺氧／復氧＋丙泊酚＋渥曼青霉素組）：步驟同Ⅲ組，在丙泊酚處理前10min給予100nmol／L渥曼青霉素（批號：S1952，碧云天生物技術研究所）。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 心肌細胞凋亡的檢測 采用TUNEL法（試劑盒購自Promega公司，美國）測定心肌細胞凋亡率。TUNEL陽性反應為核呈棕褐色或棕黃色顆粒，核呈TUNEL陽性反應且具備細胞凋亡的形態學特征者被判定為凋亡細胞。熒光顯微鏡下，對同一片取5個不同視野，計算凋亡率（每一片數100個細胞核中凋亡核所占的百分比）的平均值。

1.3.2 Akt、p－Akt和eNOS、p－eNOS的 Western blot檢測 取培養6d～8d的6組乳鼠心肌細胞進行蛋白提純，采用Bradford方法測定蛋白濃度。免疫印跡時加等量上樣緩沖液，并煮沸5min，然后10%分離膠／5%積層膠上進行電泳，應用電轉儀（Bio－Rad，美國）將電泳分離后的蛋白轉移至NC膜上。TBST洗滌，5min×3，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，然后用兔抗鼠Akt、磷酸化－Akt（p－Akt）、兔抗鼠eNOS、磷酸化－eNOS（p－eNOS）多克隆抗體（稀釋度1∶1 000，Cell Signal公司，美國）及兔抗鼠GADPH（稀釋度1∶1 000，北京中杉金橋生物技術有限公司，美國）4℃孵育過夜。次日用HRP標記的羊抗兔二抗 （稀釋度1∶2 000，Cell Signal公司，美國）室溫孵育1h，ECL顯影。采用凝膠成像系統（UVP公司，美國）進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與GADPH條帶灰度值的比值反映Akt、p－Akt、eNOS和p－eNOS蛋白的表達。

1.4 統計學處理 采用SPSS16.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數標準差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組心肌細胞凋亡率的比較 與Ⅰ組比較，其余各組心肌細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組心肌細胞凋亡率降低（P＜0.05），Ⅳ組心肌細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）；與Ⅲ組比較，Ⅳ組心肌細胞凋亡率升高（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 各組間心肌細胞 Akt、p－Akt和eNOS、p－eNOS蛋白表達水平的比較 各組間心肌細胞Akt和eNOS蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與Ⅰ組比較，其余各組心肌細胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達水平上調（P＜0.05）；與Ⅱ組比較，Ⅲ組心肌細胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達水平上調（P＜0.05），Ⅳ組心肌細胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達水平差異無統計學意義（P＞0.05）；與Ⅲ組比較，Ⅳ組心肌細胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達水平下調（P＜0.05）。詳見表1。

表1 各組乳鼠心肌細胞凋亡率、Akt、p－Akt、eNOS和p－eNOS蛋白表達水平比較（±s）

表1 各組乳鼠心肌細胞凋亡率、Akt、p－Akt、eNOS和p－eNOS蛋白表達水平比較（±s）

組別 n 凋亡率（%） Akt p－Akt eNOS p－eNOSⅠ組10 6.5±0.2 100±23 20.1±5.2 94±13 15.3±3.3Ⅱ組 10 42.3±1.81） 105±20 37.2±6.51） 96±13 30.2±4.51）Ⅲ組 10 21.6±2.51）2） 110±25 68.2±5.81）2） 97±15 51.2±6.21）2）Ⅳ組 10 40.2±2.01）3） 108±21 40.3±6.11）3） 94±15 32.3±5.71）3）與Ⅰ組比較，1）P＜0.05；與Ⅱ組比較，2）P＜0.05；與Ⅲ組比較，3）P＜0.05

3 討 論

本研究結果表明，與Ⅰ組比較，Ⅱ組心肌細胞凋亡率顯著升高，提示乳鼠離體心肌細胞缺氧／復氧損傷模型制備成功。而Ⅲ組在乳鼠心肌細胞缺氧的同時加入50μmol／L丙泊酚后，結果顯示丙泊酚可減少心肌細胞凋亡，減輕心肌細胞缺氧／復氧損傷；本研究還提示丙泊酚可上調缺氧心肌細胞p－Akt和p－eNOS蛋白的表達，在給予PI3K特異性抑制劑渥曼青霉素后，p－Akt和p－eNOS表達下調，心肌細胞凋亡率升高，丙泊酚心肌細胞保護作用消失，提示PI3K－Akt－eNOS信號轉導通路介導了丙泊酚減輕心肌細胞缺氧／復氧損傷的作用。

細胞凋亡機制主要有兩種，一種是通過激活caspase－8和caspase－3死亡通路，一種是線粒體信號通路[5]。既往研究已證 實，丙泊酚可以通過下調caspase－3、caspase－8以及上調Bcl－2表達發揮抗心肌細胞凋亡的作用[6－8]；丙泊酚也可以通過抑制線粒體膜電位和膜通透性轉換，減少細胞色素C和凋亡誘導因子從線粒體的釋放而發揮抗心肌細胞凋亡的作用[9－11]。

而細胞凋亡的這兩種通路都被認為是PI3K－Akt通路的下游通路，受PI3K－Akt通路的調控[12，13]。PI3K超家族在細胞生長、增殖、存活和凋亡過程中發揮重要作用。Akt是PI3K激活后的下游效應器。Akt磷酸化后被激活，激活的Akt可磷酸化eNOS第1177位絲氨酸，使eNOS激活。eNOS是合成NO的限速酶，NO可激活蛋白激酶C和線粒體ATP敏感性鉀離子通道，抑制線粒體通透性轉換孔的開放，降低線粒體膜通透性，抑制線粒體內鈣超載，改善線粒體功能，抑制線粒體釋放凋亡因子而調 控細 胞 凋 亡 過 程[14，15]。PI3K－Akt通 路 也 可 通 過 調 控caspase－3、caspase－8以及Bcl－2家族參與抗心肌細胞凋亡的心肌保護作用。那么PI3K－Akt－eNOS通路是否參與了丙泊酚的上述抗心肌細胞凋亡作用尚待研究。

本研究 Western blot結果顯示，心肌細胞缺氧／復氧損傷后，心肌細胞p－Akt和p－eNOS蛋白表達上調，而給予丙泊酚后p－Akt和p－eNOS蛋白表達進一步上調，然而這一效應可被PI3K特異性抑制劑渥曼青霉素消除，提示PI3K－Akt－eNOS通路可能參與了丙泊酚的抗心肌細胞凋亡作用。

綜上所述，PI3K－Akt－eNOS信號轉導通路介導了丙泊酚減輕缺氧／復氧致乳鼠心肌細胞凋亡的作用。

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