糖尿病并腦梗死大鼠模型的建立體會

王海濤，楊明峰，孫保亮，曹曉嵐

隨著社會人口老齡化及生活方式的改變，糖尿病的患病率呈逐年上升趨勢，嚴重威脅人類健康。臨床上反復發作的缺血性腦卒中患者10%～30%合并有糖尿病；缺血性腦卒中死亡病人中，糖尿病是非糖尿病病人的2倍或以上。因此糖尿病與腦缺血的關系日益受到人們的重視。糖尿病合并腦梗死時腦損傷機制亟需滿意的動物模型來模擬實際的發病情況，目前，國外用于糖尿病研究的動物模型多為遺傳型[1]，如ob／ob小鼠、db／db小鼠及肥胖型Zucker大鼠、OLETF大鼠等，其來源在我國相當困難且十分昂貴，不利于研究的開展。國內有采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘發慢性實驗性糖尿病大鼠，在此基礎上制作大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）模型[2－5]，但因所選糖尿病模型和腦缺血模型的不同，結果不盡一致。本實驗在鼠糖尿病模型的基礎上，應用線栓法制備大鼠MCAO模型，成功制備了糖尿病并腦梗死大鼠模型，現將實驗操作方法及所得經驗教訓總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物分組 健康5周齡雄性Spraque－Dawley（SD）大鼠40只，隨機分為假手術對照組（Sham組）、單純腦梗死組（MCAO組）、單純糖尿病組（DM組）、糖尿病腦梗死組（DM＋MCAO組），每組10只。假手術對照組及單純腦梗死組給予普通飼料喂養，單純糖尿病組和糖尿病腦梗死組給予高脂高糖飼料喂養，實驗過程不合格及死亡大鼠在后續試驗中予以補齊。1.1.2 主要試劑與材料 普通飼料和高脂高糖飼料（普通飼料中添加10%豬油、10%蛋黃粉和20%蔗糖）。飼料由泰山醫學院實驗動物中心提供，喂養前1周臨時配制，壓制成形后喂養。STZ由美國Sigma公司生產；2，3，5－氯化三苯基四氮唑（TTC）：北京索萊寶公司產品。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病動物模型的制備 參照文獻[6]制作糖尿病大鼠模型，高脂高糖飼料喂養至4周后，所有動物稱重并測量血糖，繼之用腹腔注射STZ的方法建立糖尿病模型。STZ濃度為30mg／kg，注射前將STZ溶于pH為4.5的0.1mmol／L的檸檬酸緩沖液中。假手術對照組和單純腦梗死組注射同等容積的檸檬酸緩沖液，不加入STZ。隨后繼續按照原來飼料喂養方式喂養1周，用血糖儀測定血糖，若血糖≥16.7mmol／L，則判定為糖尿病大鼠[6]，動態觀察大鼠癥狀和體征，淘汰血糖不達標大鼠。

1.2.2 腦梗死模型的制備 參照經典的Longa不開顱經頸總動脈栓入尼龍線致大腦中動脈閉塞的方法[7]，腹腔內注射水合氯醛（300mg／kg）麻醉，做頸部正中切口，自頸總動脈分叉處做一微切口，插入用濃鹽酸硝酸預混液預處理過的3號魚線（0.26mm直徑），插入深度18mm～20mm。假手術對照組和單純糖尿病組同樣進行手術，但線栓插入深度為10mm并且1 min后拔出。

1.2.3 糖尿病腦梗死模型的建立 高脂高糖飼料喂養4周，進行腹腔STZ注射，2周后測定血糖，篩選血糖合格糖尿病大鼠，進行線栓法制作腦梗死模型，進行觀察評價，有神經功能缺損者為成功模型。

1.2.4 神經功能評分標準 大鼠清醒后，大鼠全部進行行為學觀察，進行神經功能評分，參照Bederson等[8]的評定方法進行神經功能評分：0分無癥狀；1分為提鼠尾時癱瘓側前肢回收屈曲；2分為除1級體征外，大鼠向癱瘓側推時感阻力較對側明顯降低；3分為除以上體征外，大鼠爬行時向癱瘓側旋轉；不能自發行走，意識喪失為4分。評分為1分～3分則為造模成功。0分和4分者剔除。

1.2.5 腦梗死體積測定 MCAO手術后6h，大鼠斷頭取腦，放入冰鹽水中肉眼觀察大腦中動脈（MCA）系統有無血栓形成及腦組織水腫情況，顱底有無出血，迅速置于－20℃冰箱中冷凍20min，行冠狀切片，每片厚2mm，放入2%的TTC液中，置37℃溫水浴30min染色。正常組織被染成紅色，壞死組織不著色。數碼相機拍照后，應用圖像處理軟件，計算腦梗死體積。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0軟件包分析，實驗數據用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠生存狀態 正常對照組大鼠體重增加正常，反應靈敏，毛色光澤。高脂高糖飼料喂養大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素后，大鼠飲食量、飲水量明顯增加，排尿增多，體重增長緩慢，甚至出現負增長，精神萎靡，反應遲鈍，毛色失去光澤枯黃豎起。

2.2 神經功能評分及死亡率 假手術對照組和單純糖尿病組神經功能缺失評分均為0分；單純腦梗死組和糖尿病腦梗死組大鼠均出現不同程度的神經行為學異常，主要表現為右側霍納征（上瞼下垂，瞳孔散大）和左側前肢為重的癱瘓，表現為提尾時左側肢體屈曲內收緊貼胸壁，行走時有左側轉圈，或向左側傾倒等。腦梗死組神經功能評分均高于假手術組，提示腦梗死模型造模成功；糖尿病腦梗死組大鼠神經功能評分顯著高于單純腦梗死組（P＜0.05），提示糖尿病大鼠腦梗死后顯示更大的神經功能損傷。詳見表1。

表1 各組大鼠神經功能評分比較（±s） 分

表1 各組大鼠神經功能評分比較（±s） 分

組別 n 神經功能評分Sham組10 0 MCAO組 10 2.4±0.51）DM組 10 0 DM＋MCAO組 10 2.7±0.41）2）與Sham組比較，1）P＜0.05；與MCAO組比較，2）P＜0.05

2.3 梗死體積測定 TTC染色顯示梗死區域為蒼白色，假手術組及單純糖尿病組大鼠腦組織未見梗死灶，經大腦中動脈線栓的大鼠有不同程度的梗死灶，梗死范圍較恒定，主要位于大腦中動脈分布區（額頂背外側皮層、尾殼核區）。其中以糖尿病腦梗死組大鼠梗死體積最大，為（82.6±7.5）%，嚴重者幾乎全部一半的腦組織均見梗死灶，與單純腦梗死組相比，超過單純腦梗死組梗死容積的2倍，提示糖尿病后腦梗死體積增大。

2.4 模型成功情況 試驗過程中假手術組無大鼠死亡，單純腦梗死組在MCAO操作后因死亡補充4只，單純糖尿病組因死亡補充1只，因血糖不合格淘汰大鼠2只，糖尿病腦梗死組因死亡補充7只，淘汰血糖不合格大鼠2只，糖尿病腦梗死模型成功率52%。

3 討 論

高脂高糖喂養聯合小劑量STZ注射能復制出接近2型糖尿病臨床特點的大鼠模型，在糖尿病模型基礎上制作的腦梗死模型是研究糖尿病腦梗死較為理想的模型。實驗過程中的很多因素都能決定著動物模型是否能夠成功，現將在實驗過程中發現的經驗教訓總結如下。

3.1 大鼠選擇 空腹成年雄性鼠造模，糖尿病成模率較高，較幼鼠或小體重鼠更易成模型[9]。高脂高糖飼料喂養4周，大鼠體重增加明顯，但制作糖尿病模型后，大鼠體重增長緩慢，到進行線栓法階段，體重基本平衡。研究選用5周齡的SD大鼠為研究對象，初始大鼠重量為170g～190g，在進行大鼠 MCAO模型制作階段重量控制在280g～310g。

3.2 藥物選擇 鏈脲佐菌素和四氧嘧啶均可用于糖尿病模型的制作，但用四氧嘧啶造模2周～3周后可有自然陰轉，且造模初期病死率較大，文獻報道較多使用鏈脲佐菌素造模。但要注意鏈脲佐菌素溶液配制后需避光冰浴，并且在30min內注射完畢，否則會對造模有影響。還要注意注射部位要正確，避免注射藥物誤入皮下，降低成模率，或因腹腔注射范圍大，注射藥物易誤入腹腔臟器，導致死亡率增高等。

3.3 栓線選擇 大鼠大腦中動脈缺血再灌注模型制作過程中對栓線的選取十分嚴格，它直接影響實驗的成敗。一般選用尼龍線為栓線，栓線的粗細與所選大鼠的體重密切相關，考慮一般選用300g左右的大鼠，故所選栓線的直徑宜為0.25mm，該直徑既易于穿入大鼠大腦中動脈又能完全阻斷大腦中動脈。插線的深度也是影響結果的重要因素，在操作之前用細標記筆在18.5mm處分別作標記。在操作的過程中筆者發現從殘端算起插線深度18.5mm左右，能制作比較符合要求的模型。避免栓線在血管內來回反復穿插而損傷血管內皮，繼發血栓形成。

3.4 關于麻醉 用10%的水合氯醛，按350mg／kg給藥。有報道認為避免麻醉過量，先給予總量的2／3，如麻醉不夠再加量。在實踐中此法不大可取。應該一次性給予總量，否則麻醉效果不佳，再次注射多會抑制呼吸引起死亡。按以上麻醉劑量，大鼠2h后多會醒來，此時可通過了解大鼠是否有神經功能缺損以判斷栓塞是否成功。

3.5 關于護理 在手術中曾遇到大鼠呼吸急促、氣道分泌物增加，以至于大鼠死亡的現象，所以一定要保持呼吸道通暢，可在手術中將大鼠舌頭拉向一側，這樣明顯減少肺水腫的發生。麻醉期間一定要保溫，如保溫不當，大鼠死亡率會大幅增加。醒后室溫宜保持在26℃～30℃。大鼠手術暴露處術中組織液揮發較多，故可考慮腹腔補1mL～2mL的生理鹽水，如術中有出血或操作時間過長，可適當加量。

3.6 手術操作 分離血管要較徹底，避免結扎、牽拉伴隨的神經。翼腭動脈的處理，頸內動脈在入顱前有一個粗大的分支腭翼動脈，在分離時切忌不能損傷這個血管，插線的過程中線栓可能會誤入此分支血管，所以在操作過程中要予以注意。插完后進行檢查，防止誤入此血管。

總之，建立具有重復性、穩定性好，生理指標控制嚴格的標準化模型是研究糖尿病并腦梗死必不可少的工具，而在實際操作中每個細節往往都影響著模型的質量，所以，重視并嚴格操作實驗中的每一個步驟，不斷總結經驗，模型制作就會越來越完善。

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