高糖環境對小鼠細胞免疫功能的影響

李思敏，楊 靜

近來糖尿病被認為是一種慢性低度促炎癥狀態，表現為循環中的單核細胞及炎癥因子水平升高，并且認為細胞因子如腫瘤壞死因子－α（TNF－α）、白介素－6（IL－6）與糖尿病動脈粥樣硬化及心腦血管疾病有著密切聯系[1]。很多實驗表明高糖可以引起體內細胞因子水平的變化，但是在高糖環境下細胞因子的濃度如何變化，不同的研究結果不盡一致。有研究表明糖尿病患者血中免疫細胞分泌的Th1型細胞因子[如干擾素－γ（IFN－γ）、白介素－12（IL－12）]濃度比正常糖濃度者血中免疫細胞分泌的 Th1型細胞因子濃度高，而Th2型細胞因子（如IL－4、IL－10）的濃度是降低的[2]。但也有研究表明1型糖尿病（TIDM）患者外周血中的CD4＋、CD8＋T細胞產生的IFN－γ與正常糖濃度者相比是顯著降低的[3]。而有關小鼠脾細胞的研究報道較少，本實驗采用體外培養小鼠脾細胞，以不同糖濃度刺激，檢測細胞因子的表達情況，探求高糖環境對免疫細胞功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 C57BL／6雌性清潔級小鼠（6周齡）購自北京大學醫學部－北京華阜康生物科技股份有限公司；RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺及青霉素、鏈霉素購自美國 GIBCO公司；HEPES、D－葡萄糖、PMA、Ionomycin、脂多糖（LPS）及刀豆凝集素（ConA）購自美國SIGMA公司；CytoTox 96?非放射性細胞毒性檢測試劑盒購自美國PROMEGA公司；ELISA檢測試劑盒與流式細胞術檢測試劑盒均購自美國BD公司。

1.2 分離小鼠脾細胞 頸椎脫臼法處死小鼠，用75%酒精消毒腹部皮膚及四肢，無菌條件下剖開小鼠腹腔取出脾臟，置于不含FBS的RPMI 1640培養基中，并去除周圍結締組織，待所有脾臟均取出后，用2.5mL注射器內芯通過40μm細胞過濾網研磨，收集細胞懸液于15mL離心管中，并加入含5%FBS的RPMI 1640培養基將細胞吹打混勻，離心后裂解紅細胞并用RPMI 1640培養基清洗2遍，最后細胞重懸于RPMI 1640無糖培養基中。

1.3 細胞培養及實驗分組 調整細胞濃度為3×106／mL，培養于含5%FBS、2mmol／L谷氨酰胺、100U／mL青霉素、0.1mg／mL鏈霉素及25mmol／L HEPES的RPMI 1640培養基中，加入LPS（1μg／mL）及ConA（5μg／mL）為刺激T、B淋巴細胞增殖。實驗分為3組：5.5mmol／L糖濃度組（5.5mmol／L組）、11.1mmol／L糖濃度組（11.1mmol／L組）和25mmol／L 糖濃度組（25mmol／L組），置于37℃、5%CO2培養中孵育。

1.4 非放射性細胞毒性檢測 定量檢測乳酸脫氫酶（LDH），LDH是一種穩定的胞質酶，在細胞裂解時會釋放至培養基上清中，分別于6h、24h、48h收集各孔培養基，離心后各取150μL上清加到96孔板中，每孔50μL，每個樣品設3個復孔，然后通過30min偶聯的酶反應來檢測，用BioTek－ELX808酶標儀在490nm處讀板。所有操作均按試劑盒說明書進行，以RPMI 1640培養基為陰性對照孔，靶細胞最大釋放量采用反復凍融法。

1.5 細胞因子檢測 ELISA法檢測6h、24h、48h培養細胞上清中IFN－γ、TNF－α、IL－6及IL－10的濃度，所有操作均按試劑盒說明書進行，用BioTek－ELX808酶標儀在450nm處讀板。

1.6 流式細胞術 提前4h在每孔細胞中加入PMA（終濃度為5ng／mL）與Ionomycin（終濃度為500ng／mL），置于37℃、5%CO2培養中孵育1h后，每孔加入1μL Protein Transport Inhibitor，繼續置于37℃、5%CO2培養中孵育3h。然后將培養24h的細胞分別收集于離心管中，4℃離心（1 400rpm、8 min）后棄上清，每管加100μL的Fc Block，4℃放置15min后進行胞外染色，所有樣品加CD3e－FITC抗體，4℃避光放置30 min后每管加1mL的staining buffer清洗細胞，離心后加入200μL的Fixation and Permeabilization重懸細胞，再加1mL的Perm／Wash buffer清洗細胞2遍，加入TNF－αPE單抗，4℃避光放置30min后清洗一遍，將細胞重懸于250μL的staining buffer中，混勻，上機，經FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）每管分選出CD3＋T細胞亞群，收集10 000個細胞，用Cell Quest軟件分析數據，以熒光抗體染色陽性細胞的百分率記錄結果。所有操作均按試劑盒說明書進行，同時設不加抗體的陰性管與FITC單染管。

2 結 果

2.1 非放射性細胞毒性檢測 以5.5mmol／L糖濃度為陰性對照孔，分別檢測11.1mmol／L和25mmol／L糖濃度在6h、24 h和48h三個時間點對小鼠脾細胞的細胞毒性，結果顯示細胞毒性均小于7%，各組間差異無統計學意義，數據未顯示。

2.2 細胞培養上清細胞因子的檢測 ELISA定量檢測細胞因子的結果表明，TNF－α在高糖刺激6h分泌最高，24h后降低，11.1mmol／L和25mmol／L糖濃度刺激的小鼠脾細胞分泌的TNF－α均顯著低于5.5mmol／L組（P＜0.01）。在24h和48 h，高糖刺激可顯著降低脾細胞分泌的IFN－γ、IL－6與IL－10產量（P＜0.05），且呈現明顯的劑量－效應關系。詳見表1、表2。

表1 不同糖濃度對小鼠脾細胞分泌TNF－α的影響（±s）

表1 不同糖濃度對小鼠脾細胞分泌TNF－α的影響（±s）

組別 n TNF－α（pg／mL）5.5mmol／L組7 226.42±21.34 11.1mmol／L組 7 171.23±24.171）25mmol／L組 7 146.01±23.741）與5.5mmol／L組比較，1）P＜0.01

表2 不同糖濃度對小鼠脾細胞分泌IFN－γ、IL－6、IL－10的影響（±s） pg／mL

表2 不同糖濃度對小鼠脾細胞分泌IFN－γ、IL－6、IL－10的影響（±s） pg／mL

項目 組別 n 24h 48h 9 3 332.06±298.95 6 950.94±885.38 11.1mmol／L組 9 1 434.05±416.182）2 519.53±113.692）IFN－γ 5.5mmol／L組25mmol／L組 9 495.26±35.562） 602.38±95.102）IL－6 5.5mmol／L組 9 160.03±19.70 297.95±25.76 11.1mmol／L組 9 149.60±16.23 173.19±20.502）25mmol／L組 9 135.32±17.681） 84.16±28.292）IL－10 5.5mmol／L組 9 128.80±21.00 278.17±35.77 11.1mmol／L組 9 72.57±5.932） 110.50±12.742）25mmol／L組 9 26.48±3.702） 80.93±8.662）與5.5mmol／L組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

2.3 流式細胞術檢測24h高糖刺激下小鼠脾細胞內分泌TNF－α的情況 結果表明CD3＋T細胞是小鼠脾細胞分泌TNF－α的主要細胞來源。在25mmol／L糖濃度刺激下，CD3＋T細胞亞群內TNF－α陽性細胞的百分比顯著均低于5.5mmol／L組和11.1mmol／L組（P＜0.05）。詳見表3。

表3 小鼠脾細胞在不同糖濃度刺激下CD3＋T細胞內TNF－α陽性細胞檢測結果（±s） %

表3 小鼠脾細胞在不同糖濃度刺激下CD3＋T細胞內TNF－α陽性細胞檢測結果（±s） %

組別 n TNF－α 5.5mmol／L組3 16.48±0.68 11.1mmol／L組 3 16.25±0.77 25mmol／L組 3 13.83±1.411）與5.5mmol／L組比較，1）P＜0.05

3 討 論

糖尿病是以慢性血糖升高為主要表現的代謝性疾病，近來認為糖尿病與免疫功能紊亂有密切聯系。高血糖是參與糖尿病免疫發病機制的一個重要因素，通過直接或間接的機制引起生物化學及代謝性的改變從而導致胰腺功能及結構的改變[4－6]。Maedler等[7]通過培養人胰島細胞發現高血糖可以誘導IL－1β釋放，而且糖尿病病人對感染的敏感性增加與血糖控制不好是相關的[8]。有實驗表明[9]，體外培養人單核細胞株（THP1），在高糖刺激下其分泌 TNF－α、IL－6及IL－1β濃度是升高的。但也有實驗表明[10]，體外培養THP1，給予高糖刺激后，高糖使IL－1β的表達減弱，且表達降低存在葡萄糖濃度依賴性。而對于在體內發揮重要免疫功能的脾細胞的研究卻很少，為了探討脾細胞在高糖環境下免疫功能會發生怎樣的改變，本實驗通過體外培養小鼠原代脾細胞，給予不同糖濃度的刺激，用ELISA及流式細胞術檢測細胞因子的變化情況，發現隨著糖濃度的升高，TNF－α、IFN－γ、IL－6及IL－10四種細胞因子的濃度均降低。這與文獻[11]的實驗結果一致，他們用高糖培養小鼠脾細胞發現細胞因子 TNF－α、IFN－γ和IL－10的濃度在28mmol／L糖濃度刺激下比2.8mmol／L糖濃度刺激下低，但是并未呈現劑量－效應關系。而本實驗通過ELISA法發現在24h和48h，高糖刺激可顯著降低脾細胞分泌的IFN－γ、IL－6與IL－10產量，并呈現明顯的劑量－效應關系，且進一步通過流式細胞術確認了TNF－α主要來源于T細胞。但是我們的實驗都表明了糖尿病的高糖環境可以影響細胞因子的分泌，并且高糖與免疫共同作用導致了糖尿病患者細胞因子的改變。四種細胞因子的濃度隨糖濃度的升高而降低，可能是由于高糖可以導致T、B淋巴細胞的增殖降低，細胞的活性下降，同時促進了細胞的凋亡，并且誘導淋巴細胞的氧化應激效應。

IFN－γ主要由活化的T細胞和NK細胞產生，可以激活巨噬細胞并促進其功能，還可激活中性粒細胞和NK細胞殺傷活性，發揮抗感染的作用。此外IFN－γ還是Th1細胞的代表性細胞因子，其功能是增強吞噬細胞介導的抗感染機制，促進細胞免疫，在機體抗胞內病原體感染中發揮重要作用。同時TNF－α、IL－6及IL－10與IFN－γ在對抗病原感染有協同作用。細胞免疫對抵御胞內寄生菌，如結核桿菌、傷寒桿菌、真菌等引起的慢性感染尤為重要。而實驗結果表明高糖環境下，脾細胞分泌細胞因子的能力減弱，提示糖尿病患者更易感染可能與細胞免疫功能降低有關。

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