高效液相色譜法測定金錢草膠囊中槲皮素的血藥濃度＊

王啟平，王洪銳，李 東，朱杰華，林永勝，馮雪科，陳玩珊

(1.廣東省深圳市沙井人民醫(yī)院，廣東 深圳 518104;2.廣東省深圳市福永人民醫(yī)院，廣東 深圳 518103;3.廣東省深圳市人民醫(yī)院·暨南大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 深圳 518020;4.廣東省深圳市大鵬人民醫(yī)院，廣東 深圳 518120;5.廣東省深圳市南澳人民醫(yī)院，廣東 深圳 518121)

金錢草為《中國藥典(一部)》1985年版、2000年版、2005年 版和2010年版收載的品種[1]，來源為報春花科Prmuhceae珍珠菜屬Lysimachia雙子葉植物過路黃 Lysimachia christinae Hance的新鮮或干燥全草，因其葉子近圓形，很像金錢故名金錢草，又稱銅錢草。四川《百草堂驗方抄本》[清代乾隆年間(1736-1795)]中就有金錢草治療“黃痧走疸”的記載，“黃痧走疸周身黃，金錢草是救命王，炕干為末沖甜酒，草藥更比官藥強”，迄今至少有200年的應用歷史。金錢草味苦、酸，微寒，歸肝、膽、腎、膀胱四經，主治清熱解毒、利尿排石、活血散瘀[2-4]。中藥制劑金錢草膠囊是以金錢草新鮮或干燥全草為原料的單味現代中藥制劑，為中藥八類新藥(國藥準字Z20060007)，為全國獨家醫(yī)保品種。現代藥理研究[2-6]證明，金錢草中藥制劑口服可用于肝膽結石、膽囊炎、黃疸性肝炎、泌尿系結石、水腫、跌打損傷、毒蛇咬傷、毒蕈及藥物中毒，外用治療化膿性炎癥、燒燙傷。金錢草不良反應較少，臨床應用越來越廣泛[4]，但目前國內尚無金錢草膠囊血藥濃度測定方法的報道。筆者選擇金錢草膠囊中有效成分槲皮素(quercetin)為指標，參考國內外有關文獻[1，7-13]，并根據槲皮素的性質，建立了血藥濃度測定方法，為臨床血藥濃度測定和藥代動力學研究提供分析手段。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(G1311A四元泵，G1322A真空脫氣機，G1315B-DAD檢測器，D1316A柱溫箱，rheodyne-7725i進樣器，ChemStation色譜工作站);AG285型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司);XW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠);KQ5200DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);高速離心機(雅培公司);pHS-3C型數字pH計(上海精科雷磁儀器廠)。金錢草膠囊(四川寶光藥業(yè)有限公司，規(guī)格為每粒裝0.4g，批號為120203A);槲皮素對照品(國家藥品標準物質，供高效液相色譜法測定，含量為96.5%，批號為100081-200907，中國食品藥品檢定研究院);甲醇(色譜純，天津四友精細化工有限公司);乙腈(色譜純，天津四友生物醫(yī)學技術有限公司);β-葡萄糖苷酸酶(H-2型，美國Sigma公司);硫酸酯酶(H-1型，美國Sigma公司);磷酸、乙酸乙酯及其他試劑均為分析純，水為注射用水。所有試劑及緩沖液使用前均經過0.45μm微孔濾膜過濾。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Kromasil C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇-乙腈-0.4%磷酸溶液(40∶10∶50);流速:1 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:360 nm;進樣量:20 μL。在此色譜條件下，槲皮素的保留時間為8.8 min，理論板數按槲皮素計計算不低于3 000，峰對稱因子(AS)為 1.08，見圖 1。

2.2 溶液配制

精密稱取槲皮素對照品10 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得質量濃度為400 μg/mL的槲皮素對照品貯備液，置4℃冰箱中備用。臨用時分別取槲皮素對照品貯備液 0.05，0.10，0.50，1.50，2.50，5.00 mL，置 10 mL 容量瓶中，以流動相稀釋至刻度，得系列質量濃度對照品溶液(2.0，4.0，20.0，60.0，100.0，200.0 μg/mL)。精密量取磷酸 4 mL，置 1 000 mL 容量瓶中，加水稀釋，定容至刻度，混合均勻，經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得0.4%磷酸溶液。

2.3 樣品預處理

取全血4.0 mL，置干燥管中，靜置 30 min，10 000 r/min離心10 min。取上清液，置1.5 mL離心管中，密封，做好標記，置-20℃保存直到分析。分析前，血漿樣品室溫自然解凍后，精密吸取0.5 mL，置 10 mL 具塞錐形離心管中，加入 40 μL β -葡萄糖苷酸酶，調 pH 至 4.5～5.0，旋渦混合 30 s，37 ℃ 水解 8 h后，加入乙酸乙酯6 mL(分2次，每次3 mL)，分別旋渦提取5 min，合并萃取液，10 000 r/min離心10 min，取乙酸乙酯層，50℃水浴氮氣流吹干，殘渣以100 μL甲醇溶解，旋渦30 s，10 000 r/min離心3 min后取20 μL進樣。

2.4 方法專屬性試驗

分別取6名健康者空白血漿0.5 mL，按2.3項下操作，獲得空白血漿樣品典型色譜圖(圖1 A);將一定濃度槲皮素對照品溶液加入空白血漿中，同法操作，獲得典型色譜圖(圖1 C);健康受試者口服4粒金錢草膠囊后的血漿樣品，同法處理后得樣品色譜圖(圖1 D)。結果表明，在上述血漿樣品預處理及色譜條件下，血漿中的內源性物質及金錢草膠囊可能的代謝物均不干擾樣品測定，峰形對稱性好，基線噪音小。

2.5 標準曲線及檢測限確定

取10 mL具塞錐形離心管8支，分別精密加入健康體檢者混合空白血漿0.5 mL。除空白管外，其余每支管精確加入不同質量濃度的槲皮素對照品溶液20 μL，旋渦混合30 s，得質量濃度分別為 0.08，0.16，0.80，2.40，4.00，8.00，12.00 μg/mL 的系列血漿樣品，然后按血漿樣品預處理方法處理后進樣分析，記錄槲皮素峰面積，并以峰面積(A)對槲皮素對照品質量濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程 A=385.85 C-32.518，r=0.998 8(n=7)。結果表明，槲皮素質量濃度在0.08～12 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.6 方法回收率及精密度試驗

用空白血漿及對照品溶液配制質量濃度為 0.16，2.40，8.00 μg/mL的3種槲皮素質控樣品，各6份，按2.3項下方法操作，于1 d內重復測定6次;連續(xù)6 d，每天配制上述3種質量濃度的質控樣品進行測定，記錄峰面積。將測定結果代入線性方程，計算濃度，計算日內、日間精密度及方法回收率。結果見表1。

表1 方法精密度及回收率測定結果

2.7 提取回收率試驗

取空白血漿0.5 mL，加入槲皮素對照品溶液適量，分別配制0.16，2.40，8.00 μg/mL 系列質量濃度的溶液各 6 份，按 2.3 項下方法處理、測定;另取空白血漿0.5 mL，不加入槲皮素對照品，按2.3項下方法處理，在取乙酸乙酯層后加入相同量的槲皮素對照品溶液，旋渦30 s，同法吹干，復溶后測定。將兩組樣品對應質量濃度的槲皮素峰面積進行比較，計算提取回收率。結果見表2。

表2 提取回收率試驗結果

2.8 穩(wěn)定性考察

用空白血漿配制質量濃度為 0.16，2.40，8.00 μg/mL 的槲皮素樣品，各吸取2 mL，置離心管中，每個質量濃度9份。其中3 份在室溫下放置 0，1，2，4，8，12 h 后按 2.3 項下方法處理、測定;3份進行凍融循環(huán)處理，樣品放入-20℃冰箱中冷凍，24 h后解凍、處理、測定，重復凍融3次;另外3份分別在-20℃冰箱中保存1，2，4周后，再按2.3項下方法處理、測定。3個質量濃度樣品在室溫下測定結果的 RSD分別為3.90%，3.41%，4.48%，凍融循環(huán)條件下測定結果的 RSD分別為4.70%，4.89%，4.03%，冷凍條件下測定結果的 RSD為6.98%，4.09%，4.36%。結果表明，槲皮素樣品在室溫放置和冷凍條件下均有較好的穩(wěn)定性。

3 討論

目前有關藥代動力學的研究多集中在化學藥物，對中藥藥代動力學的研究相對較少。中藥藥代動力學的研究與發(fā)展對于中藥新藥設計，改進中藥劑型，提供高效、速效、長效、低毒副作用的中藥制劑，特別是對于指導臨床合理用藥、推動中藥現代化、中藥走向世界都具有重大的現實意義[14]。金錢草膠囊為中草藥金錢草單方制劑，槲皮素是金錢草的主要有效成分之一，主要以苷的形式存在。為研究金錢草制劑的人體藥代動力學，筆者建立了金錢草膠囊中有效成分槲皮素的血藥濃度測定方法。

槲皮素屬多羥基黃酮類化合物，具有多種生理活性。曾試用了Hypersil ODS C18柱和Kromasil C8柱兩種色譜柱，峰形上無明顯差異，但后者的保留時間更適當，因此選用C8柱。配制質量濃度為4 μg/mL的槲皮素對照品甲醇溶液，在200～700 nm波長范圍內掃描，結果在360～374 nm波長處有明顯吸收。參照文獻[7-8]及《中國藥典(一部)》[1]，將檢測波長定為 360 nm，在此波長下，溶劑、內源性雜質及金錢草可能的代謝物均無干擾。

槲皮素的測定多以甲醇、乙腈和稀磷酸為基礎流動相[1，7-10]，在此基礎上對最佳流動相比例及磷酸濃度進行了篩選。槲皮素為多羥基化合物，弱酸性環(huán)境可抑制其解離，有利于其快速分離，曾試驗了3個濃度的磷酸水溶液，最終選擇0.4%。與甲醇和乙腈相比，磷酸溶液的比例可對分離時間及峰形產生明顯影響，綜合考慮保留時間、靈敏度，最終選擇以甲醇-乙腈 -0.4% 磷 酸溶液(40∶10∶50)為流動相，保留時間約為8.8 min，峰形、靈敏度和分離效果好。

植物中以苷形式存在的槲皮素進入人體胃腸道，在腸黏膜水解后以苷元的形式吸收，進入血液后主要以結合形式存在，未能檢測到游離槲皮素[11-12]。因此要測定人體內的槲皮素，需要對生物樣品進行水解，以獲得游離槲皮素苷元[10]。2010年版《中國藥典(一部)》采用的是酸水解方式[1]，需加熱回流較長時間，不適于取樣量較小的生物樣本。在本研究中，血漿樣本的處理采用酶水解后溶劑萃取方式，通過優(yōu)化水解條件、提取溶劑、提取方式等可獲得較好效果，但不足之處是水解時間比較長。對3名服用金錢草膠囊的志愿者血樣檢測結果表明，在優(yōu)化的色譜條件及血樣處理條件下，色譜峰分離度好，內源性物質無干擾，專屬性、準確度、精密度、線性及最低定量檢測限符合要求，可用于人體藥代動力學、生物等效性分析。

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