HuR蛋白對SH－SY5Y細胞活力的影響1）

孫雪菲，司沛沛，楊小榮，張 策

HuR是RNA結合蛋白（RNA－binding proteins，RBPs）中果蠅胚胎致死異常視覺（embryonic lethal abnormal vision，ELAV）家族的一員，它通過和細胞內mRNA非翻譯區富含Au元件（ARE）的結合，保持mRNA的穩定性，使之不易被降解而增強其表達，發揮其轉錄后的調控作用。HuR蛋白作為ELAV家族中唯一一種廣泛表達的蛋白，能在多種細胞系中表達，并參與生物發育的正常生命活動過程。

SH－SY5Y細胞是1970年建自骨瘤轉移灶的神經母細胞瘤SK－N－SH細胞系經三次克隆后的亞系（SK－N－SH→SH－SY→SHSY5→SH－SY5Y）。該細胞繁殖快，細胞形態、生理和生化功能與正常神經細胞相似，被廣泛應用于神經系統疾病發病機制和藥物作用機制方面的研究。

本實驗擬通過RNA干擾技術，探討HuR基因沉默后對SH－SY5Y細胞活力的影響，初步闡明HuR蛋白在SH－SY5Y細胞的發生和發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體 細胞培養試劑DMEM、F12、增強型考馬斯蛋白定量試劑盒購自博士德，澳洲血清（FBS）購自Gibico公司。質粒提取試劑盒購自全式金生物有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、Opti－MEM無血清培養基購自Invitrogen公司。兔抗人HuR抗體購自Abcam公司。細胞裂解液購自武漢碧云天生物科技有限公司。cck－8試劑盒購于Dojindo公司，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。β－actin山羊抗兔二抗購自中杉金橋；Super ECL Plus超敏發光液購自普利萊基因技術有限公司。

1.2 細胞培養 SH－SY5Y細胞株購自上海中科院細胞庫，用含有10%FBS、100U／mL青霉素、100U／mL鏈霉素的DMEM和F12培養基，將細胞以1×105的濃度接種于孔板或培養瓶中，在37℃含5%CO2孵箱中培養。

1.3 質粒構建與轉染 HuR干擾質粒（5′－AAGGACGTAGAAGACATGT－3′）由廣州復能基因構建。轉染時按照轉染試劑Lipofectamine 2000與質粒比例為1∶2.5轉染。

1.4 Western blot檢測與分析 HuR干擾質粒轉染后24h裂解細胞收集蛋白，蛋白定量用增強型考馬斯亮藍蛋白定量（博士德）。10%的SDS－PAGE電泳（80V，20min；120V，90min）后，將蛋白轉到PVDF膜上，TBST洗膜三次，每次5min。0.3%明膠室溫封閉1h。加入 HuR（1∶3 000）、β－actin（1∶3 000）抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜后孵二抗（1∶3 000），室溫孵育1.5h。洗膜后膜上鋪ECL超敏發光液，用凝膠成像系統成像，并加以分析。

1.5 CCK－8（Cell counting Kit－8）的測定 96孔板中的細胞在轉染24h后，每孔加入CCK－8 10μL，37℃避光培養2h，上酶標儀測定，檢測波長450nm，參比波長650nm。

1.6 LDH釋放的檢測 六孔板中的細胞轉染24h后 ，收集細胞培養液，按照說明書進行LDH活性的檢測。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0分析。數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。

2 結 果

2.1 HuR表達水平的檢測 Western Blot檢測結果顯示：與正常組相比，干擾組HuR蛋白表達顯著下調，其蛋白抑制率為77.05 %（P＜0.05）；而空質粒組、lipo2000組的HuR蛋白水平與對照組之間無統計學意義。詳見圖1。

圖1 HuR蛋白表達水平的檢測

2.2 CCK－8檢測 HuR干擾組的細胞活力下降，約為對照組的52.28%（P＜0.05）；與對照組相比，lipo2000組和空質粒組的細胞活力均無統計學意義。詳見圖2。

圖2 細胞活力觀察

2.3 LDH釋放的檢測 與對照組相比，HuR干擾組的LDH水平增高約83.37%（P＜0.05），lipo2000組和空質粒組對LDH的釋放無統計學意義。詳見圖3。

圖3 LDH釋放觀察

3 討 論

HuR可通過一定的信號途徑以及剪接、磷酸化、乙酰化等多種修飾參與細胞增殖、分化等多種行為的調節[1，2]，并在神經發育和細胞分化中具有重要作用[3]。近年研究發現[4－14]，HuR在PI3K／AKT／NF－κB、p38／MAPK 等細胞信號轉導通路中或應激、低氧條件啟動下可以穿過細胞核到達細胞漿，通過和細胞內mRNA非翻譯區富含Au元件（ARE）的結合，保持mRNA的穩定性，使之不易被降解，而加強靶因子的翻譯表達。目前認為HuR在許多生理、病理過程中發揮重要作用。例如，Lal等發現HuR可通過增強多種抗凋亡蛋白（如凋亡抑制體前胸腺素α）的表達，在細胞早期的應激反應中具有抗凋亡作用[15]；HuR可上調上皮細胞生長因子及粒細胞集落刺激因子的表達而促進細胞增殖；HuR通過調控mRNA的穩定性，使環氧化酶2（cyclooxygenase－2，COX－2）蛋白表達增加，促進腫瘤細胞增殖而發揮其致癌作用[16]。

本研究發現將HuR基因沉默后，細胞活力下降，表明HuR蛋白在SH－SY5Y細胞的發生和發展中發揮重要作用。HuR沉默后，炎癥因子 mRNA轉錄明顯減少[17]。Abdelmohsen等[18]發現在H2O2誘導的氧化應激中HuR磷酸化增加導致HuR與SIRT1mRNA結合減少，SIRT1mRNA的穩定性下降，SIRT1表達下調，細胞損傷增多。因此推測，將HuR基因在人神經母細胞瘤細胞SH－SY5Y中沉默后，導致某一與細胞存活相關的靶蛋白mRNA的穩定性下降，靶蛋白表達減少，從而引起細胞活力下降，細胞損傷。但具體機制還有待進一步研究。

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