脈血康膠囊對(duì)高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝及黏附分子表達(dá)的影響

高麗娟， 楊 喬， 王 崢， 胡耀紅

(1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070;2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科，天津300052)

動(dòng)脈粥樣硬化 (atherosclerosis)是一種慢性炎 癥反應(yīng)性疾病［1］，盡管動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的因素是多方面的，但最終都導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)膜損傷，而粥樣硬化病變的形成是動(dòng)脈對(duì)內(nèi)膜損傷做出的炎癥纖維增生性反應(yīng)的結(jié)果［2］。高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一。在長(zhǎng)期高脂狀態(tài)下，增高的脂蛋白尤其是氧化低密度脂蛋白 (oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)具有高度細(xì)胞毒性，易造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷［3］。目前研究發(fā)現(xiàn)，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞可誘導(dǎo)性表達(dá)多種黏附分子，如黏附分子-1(ICAM-1)等，黏附分子可介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，促進(jìn)循環(huán)中白細(xì)胞遷移并聚集于動(dòng)脈內(nèi)膜［4-5］，參與動(dòng)脈的炎癥過程，是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要因素［6］。

脈血康膠囊為水蛭經(jīng)適宜的加工制成的膠囊劑。水蛭為水蛭科動(dòng)物螞蝗Whitmania pigra Whitman、水蛭 Hirudo nipponica Whitman或柳葉螞蝗Whitmania acranulata Whitman的干燥全體，具有破血逐瘀通經(jīng)的功效。目前有關(guān)水蛭素的研究已有很多，天然水蛭素是從水蛭中提取的一種抗凝血蛋白質(zhì)，具有抗凝、抗血栓等作用，是迄今為止世界上最強(qiáng)的凝血酶抑制劑，在治療各種血栓性疾病及彌散性血管內(nèi)凝血中均有很好的預(yù)防及治療效果，由于它安全且沒有副作用，因而比肝素更有優(yōu)越性。1986年，隨水蛭素的cDNA被克隆出來之后，重組水蛭素的研究取得了很大的進(jìn)步。傳統(tǒng)中藥是干燥的水蛭全體入藥，對(duì)水蛭干燥全體的基礎(chǔ)研究甚少，對(duì)其作用機(jī)制更是未知。臨床觀察顯示脈血康膠囊對(duì)心腦血管疾病［7-8］、外周血管疾病有較好療效。本實(shí)驗(yàn)通過觀察脈血康對(duì)高脂血癥大鼠脂質(zhì)代謝、一氧化氮 (NO)水平及主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)的影響，以探討脈血康預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化形成的可能性及其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠50只，平均體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(津)2010-0002。

1.2 藥物及主要試劑 脈血康膠囊為水蛭經(jīng)適宜的加工制成的膠囊劑，本實(shí)驗(yàn)所用藥物為脈血康膠囊內(nèi)容物即水蛭粉 (批號(hào):20110715)，由貴州信邦制藥股份有限公司提供;高脂飼料 (配方:82.7%普通飼料、2%膽固醇、0.3%膽鹽、5%蔗糖、10%豬油)和普通飼料由天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心飼料廠提供;血脂檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司;血糖試劑盒購(gòu)自保定長(zhǎng)城臨床試劑有限公司;纖維蛋白原試劑盒購(gòu)自天津美德太平洋科技有限公司;一氧化氮試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所;大鼠細(xì)胞ICAM-1酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。

1.3 主要儀器 D—320型全自動(dòng)生化分析儀 (南京英諾華醫(yī)療科技公司)，TS—6000型半自動(dòng)血凝儀 (天津美德太平洋科技有限公司)，TU—1810紫外可見分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組及處理 適應(yīng)喂養(yǎng)1周，將大鼠分為5組，即正常對(duì)照組，模型組，脈血康膠囊高、中、低 (3.0、1.5、0.3 g/kg)劑量組，每組各10只。除正常對(duì)照組外，其余各組均喂高脂飼料，次日按10 mL/kg開始灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型組灌服等容積生理鹽水，每天1次，連續(xù)8周，并于每周稱體質(zhì)量一次以調(diào)整給藥量。

2.2 觀察指標(biāo)及方法

2.2.1 血清指標(biāo) 分別于第4周和實(shí)驗(yàn)?zāi)鹘M動(dòng)物禁食 (自由飲水)12 h，次日清晨取血3 mL，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，于全自動(dòng)生化儀上測(cè)血糖、血清總膽固醇 (TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇 (LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)水平，并根據(jù)公式AI=(TC－HDL-C)/HDL-C，計(jì)算AI。實(shí)驗(yàn)?zāi)瑫r(shí)取血清，用硝酸還原酶法測(cè)血清NO的水平，具體步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2.2 血漿指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)?zāi)⊙? mL，3.2%枸櫞酸三鈉與全血按1∶9比例迅速混勻，離心取上層血漿，按試劑盒說明于半自動(dòng)血凝儀上測(cè)血漿纖維蛋白原 (FIB)水平。

2.2.3 組織指標(biāo) 頸椎脫臼處死動(dòng)物后，剖開胸、腹腔，取胸主動(dòng)脈，剝離外膜脂肪組織后于－80℃冰箱保存。取標(biāo)本待復(fù)溫后，用預(yù)冷生理鹽水漂洗，去除血跡，濾紙拭干，稱質(zhì)量，將血管浸入冷生理鹽水(生理鹽水質(zhì)量為血管的9倍)，剪碎，在冰水浴中制成10%的組織勻漿，離心取上清液，按試劑盒說明用ELISA法檢測(cè)主動(dòng)脈ICAM-1的表達(dá)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (± s)表示，多組資料組間比較采用單因素方差分析:方差齊者用 LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Tamhane's T2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 脈血康對(duì)高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響 實(shí)驗(yàn)初，各組大鼠體質(zhì)量無(wú)差異，每周各組大鼠體質(zhì)量均增加，自實(shí)驗(yàn)第2周起，模型組大鼠體質(zhì)量明顯高于正常對(duì)照組 (P＜0.05)，各治療組大鼠體質(zhì)量低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量的動(dòng)態(tài)變化 ( ± s，n=10)Tab.1 Dynam ic changes of body weight in rats( ± s，n=10)

表1 大鼠體質(zhì)量的動(dòng)態(tài)變化 ( ± s，n=10)Tab.1 Dynam ic changes of body weight in rats( ± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組比較，☆P＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg－1)體質(zhì)量/g 0周 2周 4周 6周 8周正常對(duì)照組 － 177.9±13.9 261.8±24.5 320.8±33.6 368.2±38.6 369.1±42.4模型組 － 185.9±17.0 285.5±32.0☆ 357.4±45.7☆ 410.0±51.1☆ 436.7±62.1☆脈血康組 0.3 180.0±14.0 271.4±14.1 325.0±20.8 387.5±22.9 396.6±25.0脈血康組 1.5 179.4±22.6 278.8±22.2 347.0±35.3 404.8±44.5 420.1±51.8脈血康組 3.0 180.0±16.2 279.3±18.2 345.3±29.4 373.2±30.6 420.0±41.0

3.2 脈血康對(duì)高脂血癥大鼠血糖的影響 第4周時(shí)，各組大鼠血糖無(wú)差異。第8周時(shí)，模型組大鼠血糖明顯高于正常對(duì)照組 (P＜0.01)，各治療組大鼠血糖明顯低于模型組 (P＜0.01)，提示脈血康有降糖作用，見表2。

表2 大鼠血糖的動(dòng)態(tài)變化( ± s，n=10)Tab.2 Dynam ic changes of b lood glucose in rats( ± s，n=10)

表2 大鼠血糖的動(dòng)態(tài)變化( ± s，n=10)Tab.2 Dynam ic changes of b lood glucose in rats( ± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組比較，☆☆P＜0.01;與模型組比較，※※P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1)血糖/(mmol·L －1)4周 8周正常對(duì)照組 － 3.78±0.30 4.08±0.52模型組 － 3.65±0.48 6.01±0.99☆☆脈血康組 0.3 4.57±1.15 4.53±0.49※※脈血康組 1.5 3.31±0.74 4.38±0.68※※脈血康組 3.0 4.39±0.98 4.75±0.81※※

3.3 脈血康對(duì)高脂血癥大鼠血脂的影響 第4周時(shí)，模型組大鼠血清TC、LDL-C水平較正常對(duì)照組明顯升高，HDL-C水平明顯降低 (P＜0.01)，提示高脂血癥造模成功;各治療組大鼠血清TC、LDL-C水平較模型組有降低趨勢(shì)，HDL-C有升高趨勢(shì);各組大鼠血清TG水平無(wú)顯著差異。第8周時(shí)，模型組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均較正常對(duì)照組明顯升高，HDL-C水平明顯降低 (P＜0.05或 P＜0.01);各治療組大鼠血清TG、TC、LDL-C水平較模型組明顯降低，HDL-C水平明顯升高 (P＜0.05或P＜0.01)，提示脈血康有調(diào)脂作用，見表3。

3.4 脈血康對(duì)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù) (AI)的影響 模型組大鼠AI較正常對(duì)照組明顯升高 (P＜0.05)，各治療組大鼠 AI較模型組有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表3 大鼠血脂的動(dòng)態(tài)變化( ± s，n=10)Tab.3 Dynam ic changes of blood lipids in rats( ± s，n=10)

表3 大鼠血脂的動(dòng)態(tài)變化( ± s，n=10)Tab.3 Dynam ic changes of blood lipids in rats( ± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01;與模型組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。

組 別 時(shí)點(diǎn) 劑量/(g·kg－1) TC/(mmol·L－1) TG/(mmol·L－1)LDL-C/(mmol·L－1)HDL-C/(mmol·L－1)正常對(duì)照組 4周 －1.54±0.16 1.31±0.11 0.46±0.05 1.32±0.25 8周 － 1.65±0.25 1.27±0.24 0.57±0.08 1.18±0.25模型組 4周 － 3.05±0.94☆☆ 1.23±0.90 0.94±0.34☆☆ 0.96±0.25☆☆8周 － 3.34±0.04☆☆ 1.74±0.08☆ 1.20±0.29☆☆ 0.83±0.10☆☆脈血康組 4周 0.3 2.67±0.85 0.91±0.21 0.80±0.23 1.17±0.23 8周 0.3 2.63±0.96 1.30±0.32 0.91±0.36 0.91±0.22脈血康組 4周 1.5 2.62±0.59 0.96±0.25 0.82±0.20 1.19±0.20 8周 1.5 2.72±0.19 1.23±0.36※ 0.95±0.26 1.03±0.19※脈血康組 4周 3.0 2.60±0.72 1.02±0.22 0.78±0.25 1.20±0.18 8周 3.0 2.58±0.47※※ 1.53±0.30 0.94±0.18※※0.96±0.10

表4 大鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的變化 ( ± s，n=10)Tab.4 Changes of AI in rats( ± s，n=10)

表4 大鼠動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)的變化 ( ± s，n=10)Tab.4 Changes of AI in rats( ± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組比較，☆P＜0.05。

組 別 劑量/(g·kg－1)AI正常對(duì)照組 －1.00±0.10模型組 － 1.84±0.34☆脈血康組 0.3 1.78±0.36脈血康組 1.5 1.61±0.33脈血康組3.0 1.69±0.27

3.5 脈血康對(duì)高脂血癥大鼠血清NO和血漿FIB的影響 模型組大鼠血清NO水平較正常對(duì)照組明顯降低 (P＜0.05)，各治療組大鼠血清NO水平較模型組明顯升高 (P＜0.05)。模型組大鼠血漿FIB水平較正常對(duì)照組有升高趨勢(shì)，各治療組大鼠血漿FIB水平較模型組有下降趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

3.6 脈血康對(duì)大鼠主動(dòng)脈細(xì)胞間ICAM-1表達(dá)的影響 模型組大鼠ICAM-1的表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增強(qiáng) (P＜0.05)，各治療組大鼠ICAM-1的表達(dá)較模型組明顯減弱 (P＜0.05)，見表6。

表5 大鼠血清NO和血漿FIB的變化( ± s，n=10)Tab.5 Changes of NO and FIB in rats( ± s，n=10)

表5 大鼠血清NO和血漿FIB的變化( ± s，n=10)Tab.5 Changes of NO and FIB in rats( ± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組比較，☆P＜0.05;與模型組比較，※P＜0.05。

分組 劑量/(g·kg－1)NO/(μmol·L－1)FIB/(mmol·L －1)正常對(duì)照組 － 54.75±26.09 2.74±0.28模型組 － 26.53±13.46☆ 3.25±0.82脈血康組 0.3 54.04±30.17※ 2.82±0.58脈血康組 1.5 58.00±25.75※ 2.84±0.15脈血康組 3.0 56.36±22.70※2.86±0.70

表6 大鼠主動(dòng)脈中ICAM-1蛋白水平的變化( ± s，n=10)Tab.6 Changes of ICAM-1 protein contents in aortic wall in rats( ± s，n=10)

表6 大鼠主動(dòng)脈中ICAM-1蛋白水平的變化( ± s，n=10)Tab.6 Changes of ICAM-1 protein contents in aortic wall in rats( ± s，n=10)

注:與正常對(duì)照組比較，☆P＜0.05;與模型組比較，※P＜0.05。

分組 劑量/(g·kg－1) ICAM-1/(ng·mL－1)正常對(duì)照組 －3.98±1.29模型組 － 5.58±0.48☆脈血康組 0.3 4.19±1.10※脈血康組 1.5 4.33±1.21※脈血康組 3.0 4.40±1.30※

4 討論

高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素之一。研究表明，血脂異常，尤其是TC、LDL-C升高與血管內(nèi)皮功能紊亂獨(dú)立相關(guān)［9］。本研究采用高脂飼料造模后，大鼠血清 TC、TG、LDL-C升高，而HDL-C降低，呈現(xiàn)典型的脂質(zhì)代謝紊亂狀態(tài)，說明大鼠高脂血癥模型建立成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明脈血康可明顯降低血清TC、TG、LDLC水平，升高HDL-C水平，并降低動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù) (AI)。提示脈血康膠囊可以糾正高脂狀態(tài)下脂質(zhì)代謝紊亂，并通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。

NO是重要的病理生理因子，一氧化氮合酶(NOS)是NO合成過程的關(guān)鍵酶。NOS分為內(nèi)皮型 (eNOS)、神經(jīng)型 (nNOS)、誘生型 (iNOS)，前兩種又稱為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶 (cNOS)，主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，cNOS活性只能維持幾秒到幾分鐘，由它催化生成的NO量較少，但具有廣泛的生理功能，如抑制血小板聚集、中性粒細(xì)胞黏附，調(diào)節(jié)微血管張力等，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用［10］。iNOS主要存在于炎性細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞中，在正常情況下不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到炎性細(xì)胞因子或免疫微生物刺激時(shí)，iNOS將催化合成非生理濃度的大量NO，超過生理濃度的NO可與超氧陰離子(O－2)反應(yīng)生成過氧化亞硝基陰離子 (ONOO－)，后者是強(qiáng)氧化劑，可造成脂質(zhì)過氧化和內(nèi)皮損傷，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。NO在心血管疾病中起保護(hù)作用還是有害作用與NOS的類型、NO產(chǎn)生的量及機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)［11］。有研究報(bào)道水蛭乙醇提取物具有降低NO水平的作用［12］，但在本實(shí)驗(yàn)中，脈血康可升高NO水平。當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，內(nèi)皮原來的eNOS活性降低，NO產(chǎn)生減少，此時(shí)水蛭粉升高NO水平，提示水蛭可通過保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能升高NO水平，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成;當(dāng)炎性細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞受到炎性細(xì)胞因子或免疫微生物刺激時(shí)，iNOS表達(dá)及活性增加，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量NO時(shí)，水蛭又可以通過抑制炎癥反應(yīng)降低NO水平，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。可見在不同的病理環(huán)境中，水蛭可通過糾正NO代謝紊亂，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成。

ICAM-1是存在于細(xì)胞表面的一種糖蛋白，其中以血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)最強(qiáng)，正常情況下ICAM-1表達(dá)微弱甚至不表達(dá)，在動(dòng)脈粥樣硬化初始形成過程中，血管內(nèi)皮受損后，ICAM-1表達(dá)增加，高脂血癥時(shí)，血脂升高促進(jìn)超氧陰離子產(chǎn)生，使低密度脂蛋白發(fā)生氧化修飾。研究表明，ox-LDL可以上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向血管內(nèi)皮浸潤(rùn)，單核細(xì)胞吞噬ox-LDL變?yōu)榧せ畹木奘杉?xì)胞，最終成為充滿脂質(zhì)的泡沫細(xì)胞［13］。本研究中，模型組ICAM-1的表達(dá)較正常對(duì)照組增強(qiáng)，脈血康治療組ICAM-1的表達(dá)較模型組減弱，提示脈血康可通過抑制ICAM-1的表達(dá)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

綜上所述，高脂狀態(tài)下血脂異常、血管內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化形成的重要環(huán)節(jié)，脈血康膠囊通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、糾正NO代謝紊亂、保護(hù)血管內(nèi)皮功能及抑制ICAM-1的表達(dá)，干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的形成。此外，脈血康膠囊有明顯的降糖作用和一定的降纖維蛋白原作用。對(duì)于其調(diào)脂機(jī)制、降纖維蛋白原作用是否與促纖溶作用有關(guān)及降糖機(jī)制等問題，尚待進(jìn)一步研究。

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