密骨打老兒丸對去卵巢大鼠骨質疏松的影響

武密山， 趙素芝， 任立中， 王 茹， 白 霞， 韓紅偉， 李 彬

(1.河北醫科大學中醫學院方劑學教研室，河北 石家莊050091;2.石家莊市橋東區醫院，河北石家莊050041;3.河北醫科大學第一醫院骨科，河北石家莊050031;4.河北醫科大學生物化學教研室，河北石家莊050017)

骨質疏松癥 (Osteoporosis)是以骨量減少、骨組織顯微結構退化 (松質骨骨小梁變細、斷裂、數量減少，皮質骨多孔、變薄)為特征，以致骨的脆性增高及骨折危險性增加的一種全身骨病。本課題組前期研究表明，由淫羊藿、骨碎補、菟絲子、補骨脂等組成的補腎方藥在抑制骨丟失，改善骨密度，增強骨生物力學抗壓性能方面有明顯療效［1-7］。打老兒丸來源于《萬氏家抄方·卷四》，功用滋陰補陽，強壯筋骨，主治五勞七傷，陽事不舉，真氣衰弱，精神短少，小便無度，眼目昏花，腰膝疼痛，兩腳麻冷，不能行走。本實驗將課題組前期研究成果與打老兒丸配伍組成密骨打老兒丸，采取切除卵巢建立骨質疏松模型，用骨組織形態計量學、骨生物力學等方法探討密骨打老兒丸防治去卵巢骨質疏松大鼠骨丟失和骨質量下降的作用及機理。

1 材料與儀器

1.1 動物 3月齡SPF級雌性SD大鼠共60只，體質量 (265±15)g，實驗動物由河北省實驗動物中心提供 ［許可證號:SCXK(冀)2003-1-003］。

1.2 儀器與試劑 慢速鋸 (美國 Buehler公司產品);硬組織切片機及鎢剛刀 (德國Leica公司產品);NGS—10KNG電子萬能精密材料試驗機(日本島津公司產品);自動化圖像數字化分析儀包括光鏡和熒光顯微鏡 (日本 Nikon公司產品);Labconco冰凍真空干燥儀 (法國 LEGO公司產品);960型熒光分光光度計、AE100電子天平(中國伯樂公司產品);火焰原子吸收分光光度計(日本島津公司產品);J2—SH高速冰凍離心機(中國杭州華亭公司產品);Lunar—XR型雙能X線骨密度測定儀 (美國Lunar公司產品);ALCYON 300i型全自動生化儀 (美國Abbott Laboratories公司產品);D—800 LS智能藥物溶出儀 (天津大學無線電公司產品);大鼠代謝籠 (意大利TECN IPLAST公司產品);鹽酸四環素及鈣黃綠素 (美國Sigma公司產品);17β-雌二醇 (Sigma公司產品)，鈣、磷試劑盒、肌酐試劑盒、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)檢測試劑盒 (中生北控生物科技股份有限公司產品);脫氧吡啶酚ELISA試劑盒 (美國Quidel Corporation公司產品)。

1.3 中藥制備 打老兒丸來源于《萬氏家抄方·卷四》，組成為石菖蒲、干山藥、川牛膝、遠志、巴戟天、川續斷、五味子、楮實子、杜仲、山萸肉、茯神、熟地黃、小茴香、肉蓯蓉、枸杞子各等份。打老兒丸加上本課題組的前期成果［1，4-6］淫羊藿、骨碎補、菟絲子、補骨脂各等份組成密骨打老兒丸。飲片一次性購自石家莊市樂仁堂，按處方配伍后，加8倍量水，共同浸泡40min，煮沸后文火煎煮60 min，濾出藥液;藥渣加2倍水量繼續煎煮40 min，合并兩次濾液，水浴濃縮，每1 mL藥液含生藥5.5 g，相當于臨床用量的20倍。高劑量密骨打老兒丸灌胃劑量為5 mL/kg，低劑量密骨打老兒丸灌胃劑量為2.5 mL/kg。

2 方法

2.1 實驗造模與分組 健康3月齡SD雌性大鼠60只，隨機分為假手術組、模型組、雌二醇組、密骨打老兒丸低劑量組、密骨打老兒丸高劑量組，每組12只。將動物乙醚麻醉，腰背部兩側剪毛，75%乙醇消毒，假手術組大鼠背部切口，找到卵巢后，只切除少量脂肪組織后縫合;其他各組均參照本實驗室的背馱式方法［5］從背側切口摘除雙側卵巢，縫合傷口，然后涂以紅霉素軟膏抗感染，于卵巢切除1周后，給大鼠灌胃給藥。密骨打老兒丸低劑量組大鼠灌胃給予2.5 mL/kg密骨打老兒丸混懸液，密骨打老兒丸高劑量組大鼠灌胃給予5 mL/kg密骨打老兒丸混懸液，雌二醇組灌胃給予2 mg/kg雌二醇混懸液，假手術組和模型組灌胃給予等體積蒸餾水，每周記錄體質量變化，連續給藥3個月。所有大鼠在處死前第4、第3天和第14、第13天分別皮下注射鹽酸四環素30mg/kg和鈣黃綠素5 mg/kg進行熒光標記，實驗結束前1 d，收集大鼠24 h尿液，腹主動脈取血，然后處死動物，取出大鼠的第2、第4腰椎、脛骨和股骨，剔凈附著的軟組織和軟骨。

2.2 骨密度 (BMD)測定 取右側股骨，按文獻［9］分別測出股骨整體、股骨近端 (為股骨近側干骺端1/3)，股骨遠端 (為股骨遠側干骺端1/4)骨密度，最終以平均值計。

2.3 骨鈣 (b-Ca)、骨磷 (b-P)測定 取第2腰椎用10% 三氯醋酸3 mL脫鈣3次，每次24h，合并脫鈣液，取適量，用 EDTA法測鈣，計算單位骨體積的含鈣量;用硫酸亞鐵法測磷，計算單位骨體積的含磷量。

2.4 尿鈣 (u-Ca)、尿磷 (u-P)、尿脫氧吡啶酚(D-Pyr)和肌酐 (Cr)檢測 實驗結束前1 d，用大鼠代謝籠收集大鼠 24 h尿液，記錄尿量。用ELISA法測定尿中脫氧吡啶酚的量，用全自動生化分析儀測定尿中鈣、磷和肌酐的量。

2.5 血鈣 (s-Ca)、血磷 (s-P)和血清堿性磷酸酶 (ALP)分析 大鼠用乙醚麻醉后，腹主動脈取血，離心，分離血清，用全自動生化分析儀測定血清中鈣、磷和堿性磷酸酶的活性。

2.6 子宮 取出大鼠的子宮，迅速稱質量，計算子宮臟器系數。

2.7 骨組織形態計量學靜態參數和動態參數的測定 大鼠處死后取左側脛骨，用慢速鋸沿額狀面鋸開脛骨粗隆，暴露骨髓腔，于脛骨近心端1/3處橫行鋸斷脛骨，即為脛骨上段。取脛骨上段按文獻［8］進行固定、脫水、包埋、切片，然后測量靜態參數骨組織總面積、骨小梁面積、骨小梁周長和動態參數單標記周長、雙標記周長、雙標記間距，最后按公式［9］計算出相應的靜態參數骨小梁厚度和動態參數標記周長百分數、骨形成率 (BFR/BV為每年新形成的骨小梁面積占骨小梁總面積的百分比，代表骨形成和骨轉換的活躍程度，此參數越高，表示骨轉換越亢進;BFR/TV為每年新形成的骨小梁面積占骨組織面積的百分比，代表每年骨小梁表面新形成骨的總量)。

2.8 腰椎生物力學參數的測定 取第4腰椎，去除棘突和關節突，把兩端面磨平且與軸線垂直，根據浮力原理，測定腰椎體積，其體積和椎體高的比值作為椎體平均橫截面積，按文獻［12］進行椎體壓縮試驗，然后計算出生物力學參數彈性載荷 (N)、最大載荷 (N)、斷裂載荷 (N)、剛度 (N/mm)。

3 結果

3.1 對骨密度 (BMD)，骨鈣 (b-Ca)、骨磷 (b-P)的影響 見表 1。與假手術組比較，模型組BMD、b-Ca、b-P明顯降低 (P＜0.01)。與模型組相比，密骨打老兒丸高劑量組、密骨打老兒丸低劑量組、雌二醇組 BMD、b-Ca、b-P顯著增加 (P＜0.01)。

表1 對去卵巢骨質疏松大鼠骨密度、骨鈣、骨磷的影響( ± s，n=12)Tab.1 Effects of M igu Dalao'er Pills on BMD in thighbone and calcium phosphorus in the second lum bar vertebra of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

表1 對去卵巢骨質疏松大鼠骨密度、骨鈣、骨磷的影響( ± s，n=12)Tab.1 Effects of M igu Dalao'er Pills on BMD in thighbone and calcium phosphorus in the second lum bar vertebra of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組 別 骨密度/(g·cm －2)第2腰椎b-Ca/(mg·cm－3) b-P/(mg·cm－3)假手術組0.198±0.017 0.365±0.013 0.134±0.003模型組 0.161±0.016＊＊ 0.327±0.015＊＊ 0.122±0.005＊＊密骨打老兒丸低劑量組 0.185±0.019▲▲ 0.348±0.023▲▲ 0.131±0.007▲▲密骨打老兒丸高劑量組 0.191±0.017▲▲ 0.357±0.025▲▲ 0.132±0.008▲▲雌二醇組 0.192±0.018▲▲ 0.358±0.024▲▲ 0.133±0.006▲▲

3.2 對尿鈣 (u-Ca)、尿磷 (u-P)和尿脫氧吡啶酚/尿肌酐 (D-Pyr/Cr)的影響 見表2。與假手術組比較，模型組u-Ca、D-Pyr/Cr顯著增加 (P＜0.01)，u-P無明顯變化 (P＞0.05)。與模型組相比，密骨打老兒丸高劑量組、密骨打老兒丸低劑量組、雌二醇組u-Ca、D-Pyr/Cr顯著減少 (P＜0.01)，u-P無明顯變化 (P＞0.05)。

表2 對去卵巢骨質疏松大鼠尿鈣、尿磷和尿脫氧吡啶酚/尿肌酐的影響( ± s，n=12)Tab.2 Effects of M igu Dalao'er Pills on D-Pyr/Cr and calcium phosphorus in the urine of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

表2 對去卵巢骨質疏松大鼠尿鈣、尿磷和尿脫氧吡啶酚/尿肌酐的影響( ± s，n=12)Tab.2 Effects of M igu Dalao'er Pills on D-Pyr/Cr and calcium phosphorus in the urine of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組 別 (D-Pyr/Cr)/(mmol·mg－1) 尿 液u-Ca/(mg·mg－1) u-P/(mg·mg－1)假手術組4.81±0.62 0.82±0.14 1.84±0.16模型組 8.65±0.71＊＊ 1.34±0.17＊＊ 1.71±0.18密骨打老兒丸低劑量組 5.95±0.79▲▲ 0.92±0.16▲▲ 1.76±0.18密骨打老兒丸高劑量組 5.26±0.73▲▲ 0.85±0.19▲▲ 1.78±0.16雌二醇組 5.32±0.78▲▲ 0.84±0.21▲▲1.77±0.17

3.3 對血鈣 (s-Ca)、血磷 (s-P)、血清堿性磷酸酶 (ALP)和子宮臟器系數的影響 見表3。與假手術組比較，模型組血清 ALP顯著增加 (P＜0.01)，子宮臟器系數降低 (P＜0.01)，s-Ca、s-P無明顯變化 (P＞0.05)。與模型組相比，密骨打老兒丸高劑量組、密骨打老兒丸低劑量組、雌二醇組ALP活性顯著降低 (P＜0.01)，雌二醇組的子宮臟器系數升高 (P＜0.01)，各組 s-Ca、s-P無明顯變化 (P＞0.05)。

表3 對去卵巢骨質疏松大鼠血鈣、血磷、血清堿性磷酸酶和子宮臟器系數的影響( ± s，n=12)Tab.3 Effects of M igu Dalao'er Pills on ALP and calcium phosphorus in the serum and uterus/body weight of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

表3 對去卵巢骨質疏松大鼠血鈣、血磷、血清堿性磷酸酶和子宮臟器系數的影響( ± s，n=12)Tab.3 Effects of M igu Dalao'er Pills on ALP and calcium phosphorus in the serum and uterus/body weight of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組 別 (子宮/體質量)/(mg·g－1) ALP/(U·L－1) 血 清s-Ca/(mg·L －1) s-P/(mg·L －1)假手術組1.85±0.11 74.12±9．65 11.02±0.21 3.08±0.13模型組 0.41±0.08＊＊ 99.23±8．53＊＊ 10.36±0.19 3.15±0.16密骨打老兒丸低劑量組 0.45±0.07＊＊ 78.28±10．13▲▲ 10.42±0.17 3.12±0.17密骨打老兒丸高劑量組 0.43±0.05＊＊ 75.25±9．14▲▲ 10.65±0.15 3.10±0.14雌二醇組 1.13±0.06▲▲ 74.52±10．26▲▲10.54±0.20 3.09±0.16

3.4 對脛骨上段骨組織計量學參數的影響

3.4.1 對脛骨上段骨組織計量學靜態參數的影響見表4。與假手術組比較，模型組骨組織總面積、骨小梁面積、骨小梁周長顯著降低 (P＜0.01)，骨小梁厚度無明顯變化 (P＞0.05)。與模型組相比，密骨打老兒丸高劑量組、密骨打老兒丸低劑量組、雌二醇組骨組織總面積、骨小梁面積、骨小梁周長顯著增加 (P＜0.01)，骨小梁厚度無明顯差異 (P＞0.05)。

表4 對去卵巢骨質疏松大鼠脛骨上段骨組織形態計量學靜態參數的影響( ± s，n=12)Tab.4 Effects of M igu Dalao'er Pills on the proximal tibia static histomorphometric parameters of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

表4 對去卵巢骨質疏松大鼠脛骨上段骨組織形態計量學靜態參數的影響( ± s，n=12)Tab.4 Effects of M igu Dalao'er Pills on the proximal tibia static histomorphometric parameters of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組 別 骨組織總面積/mm2 骨小梁面積/mm2 骨小梁周長/mm 骨小梁厚度/μm假手術組13.53±0.65 3.11±0.52 68.42±5.32 71.25±7.83模型組 9.12±0.62＊＊ 1.83±0.56＊＊ 43.26±5.56＊＊ 64.35±7.14密骨打老兒丸低劑量組 11.05±0.67▲▲ 2.51±0.57▲▲ 52.14±5.13▲▲ 68.23±8.16密骨打老兒丸高劑量組 11.56±0.58▲▲ 2.61±0.54▲▲ 55.72±5.28▲▲ 71.19±7.15雌二醇組 11.21±0.64▲▲ 2.57±0.61▲▲ 53.63±5.17▲▲70.65±7.24

3.4.2 對脛骨上段骨組織計量學動態參數的影響見表5。與假手術組比較，模型組骨小梁標記周長百分率、BFR/BV、BFR/TV顯著降低 (P＜0.01)。與模型組相比，密骨打老兒丸高劑量組、密骨打老兒丸低劑量組、雌二醇組骨小梁標記周長百分率、BFR/BV、BFR/TV顯著增加 (P＜0.01)。

表5 對去卵巢骨質疏松大鼠脛骨上段骨組織形態計量學動態參數的影響( ± s，n=12)Tab.5 Effects of M igu Dalao'er Pills on the proximal tibia dynam ic histomorphometric parameters of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

表5 對去卵巢骨質疏松大鼠脛骨上段骨組織形態計量學動態參數的影響( ± s，n=12)Tab.5 Effects of M igu Dalao'er Pills on the proximal tibia dynam ic histomorphometric parameters of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較。▲▲P＜0.01。

組 別 標記周長百分率/% 年骨形成率/%BFR/BV BFR/TV假手術組16.45±2.85 91.23±23.27 19.98±6.12模型組 7.01±2.16＊＊ 35.18±22.53＊＊ 5.81±5.93＊＊密骨打老兒丸低劑量組 10.35±2.43▲▲ 58.64±22.87▲▲ 12.37±5.75▲▲密骨打老兒丸高劑量組 10.83±2.38▲▲ 59.73±23.01▲▲ 12.98±6.04▲▲雌二醇組 9.83±2.15▲▲ 58.26±22.83▲▲ 12.13±5.72▲▲

3.5 對第4腰椎生物力學參數的影響 見表6。與假手術組比較，模型組彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度顯著降低 (P＜0.01)。與模型組相比，密骨打老兒丸高劑量組、密骨打老兒丸低劑量組、雌二醇組彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度顯著增加 (P＜0.01)。

表6 對去卵巢骨質疏松大鼠第4腰椎生物力學參數的影響( ± s，n=12)Tab.6 Effects of M igu Dalao'er Pills on the forth lumbar vertebrae(LV4)biomechanics parameters of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

表6 對去卵巢骨質疏松大鼠第4腰椎生物力學參數的影響( ± s，n=12)Tab.6 Effects of M igu Dalao'er Pills on the forth lumbar vertebrae(LV4)biomechanics parameters of ovariectom ized osteoporosis rats( ± s，n=12)

注:與假手術組比較，＊＊P＜0.01;與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組 別 彈性載荷/N 最大載荷/N 斷裂載荷/N 剛度/(N·mm－1)假手術組 231.62±22.15 275.61±35.69 241.23±31.27 696.32±121.37模型組 169.47±21.42＊＊ 196.14±35.26＊＊ 171.25±31.20＊＊ 458.65±124.27＊＊密骨打老兒丸低劑量組 213.25±23.64▲▲ 262.57±34.51▲▲ 218.17±32.62▲▲ 601.13±123.76▲▲密骨打老兒丸高劑量組 217.51±22.57▲▲ 265.67±35.24▲▲ 221.35±31.24▲▲ 605.28±127.85▲▲雌二醇組 211.51±22.63▲▲ 259.31±34.68▲▲ 213.34±32.54▲▲ 591.34±126.13▲▲

4 討論

絕經后婦女卵巢功能減退，雌激素水平降低，骨吸收亢進，造成骨質流失，與老齡造成的低轉化型骨質疏松相比，絕經后婦女骨質疏松屬于高轉化型骨質疏松。骨基質中90%是骨膠纖維，膠原吡啶交聯包括吡啶酚 (Pyr)和脫氧吡啶酚 (D-Pyr)兩種成熟的交聯氨基酸，D-Pyr只存在于骨骼和牙質的Ⅰ型膠原中，因牙質轉換速度慢，在整體骨骼所占的份額極小，所以尿中的D-Pyr幾乎全來自礦化骨的骨吸收。尿中D-Pyr是骨吸收最為特異敏感的指標［10］。臨床觀察絕經后婦女血清 ALP活性升高，u-Ca、尿D-Pyr排出量增加，骨吸收強于骨形成。研究發現 Pyr和 D-Pyr在絕經時增加50% ～100%，經雌激素治療后可降至絕經前水平，并在絕經兩年的追蹤研究后發現，D-Pyr測定與骨丟失率顯著相關［11］。本實驗采用去卵巢大鼠模擬絕經后婦女骨質疏松，結果顯示，去卵巢后大鼠血清ALP活性增加，u-Ca、D-Pyr/Cr排出顯著增加，與絕經后婦女骨質疏松患者的臨床生化指標的變化一致。ALP反應成骨細胞的成骨活性［12］，實驗結果表明，通過卵巢切除人為地造成卵巢功能破壞，雌激素水平下降，骨吸收代謝加強，骨基質中的Ⅰ型膠原分解加速，骨丟失率顯著上升，造成雌激素缺乏引起的骨轉換亢進骨質疏松病理模型。

打老兒丸來源于《萬氏家抄方·卷四》，組成是石菖蒲、干山藥、川牛膝、遠志、巴戟天、川續斷、五味子、楮實子、杜仲、山萸肉、茯神、熟地黃、小茴香、肉蓯蓉、枸杞子各等份。打老兒丸的配伍涉及五臟，其中以川牛膝、巴戟天、川續斷、楮實子、杜仲、山萸肉、熟地黃、肉蓯蓉、枸杞子補腎藥為主，石菖蒲、遠志、茯神養心安神，山藥補脾，五味子斂肺，小茴香溫肝。本課題組證實打老兒丸中地黃［6］、川續斷［2］、川牛膝［3］可以提高成骨細胞增殖和分化能力，再加上具有促進成骨作用的淫羊藿［5］、骨碎補［4］、補骨脂［1］、菟絲子［7］，組成密骨打老兒丸。本實驗結果表明，給去卵巢骨質疏松大鼠灌胃密骨打老兒丸3個月，血清 ALP活性顯著降低，u-Ca、D-Pyr/Cr排出量降低，骨密度增加，能夠顯著抑制由于雌激素缺乏引發的骨轉換亢進，調整骨形成和骨吸收的平衡，對遏制去卵巢造成的骨質疏松有一定的作用。并且與雌激素相比，長期服用密骨打老兒丸對子宮沒有刺激增生的作用。

骨骼在一生中不斷地進行更新和轉換，破骨細胞將其吸收，成骨細胞又不斷在原位形成新骨，兩種細胞在骨表面同一部位相繼進行著骨的重建活動，每年約有數百萬重建單位 (BMU)在骨表面上發生，骨組織內外有大量表面，包括骨外膜表面、骨內膜表面、骨小梁表面、哈佛管表面等，如果骨形成的骨量少于被吸收骨量時即發生負平衡。在BMU負平衡的狀態下，骨轉換越高，骨丟失也越嚴重，骨質疏松的發病部位主要在骨小梁。目前多用骨密度作為指標來評價骨質疏松藥效，但單純追求骨密度提高，會引起骨硬化，導致骨生物力學性能惡化，骨礦量提高和骨生物力學性能改善之間不能劃等號［7］，骨密度、含鈣、磷量僅反應骨礦的“量”，而骨的生物力學參數則反應骨的“質”，應該綜合考察反映骨“質”和“量”的雙重指標，才能更客觀地評判抗骨質疏松藥物內在質量的優劣。彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷等指標反映骨結構力學性能，而剛度用來衡量材料在載荷作用下，抵抗變形的能力。本實驗結果表明，與假手術組比較，模型組大鼠股骨骨密度、第4腰椎生物力學參數的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度均降低，脛骨上段骨組織計量學靜態參數的骨組織總面積、骨小梁面積、骨小梁周長和動態參數的標記周長百分數、骨形成率 (BFR/BV、BFR/TV)均降低，提示去卵巢誘發的大鼠骨質疏松模型是成功的。本實驗結果表明，密骨打老兒丸治療后，大鼠腰椎生物力學參數的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷、剛度，脛骨上段骨組織計量學靜態參數的骨組織總面積、骨小梁面積、骨小梁周長和動態參數的標記周長百分數、骨形成率 (BFR/BV、BFR/TV)均明顯增加。結果提示密骨打老兒丸可以防治去卵巢所致的骨質疏松大鼠腰椎生物力學性能的降低，可以增強椎骨的抗變形能力，減少骨折的發生，提高骨質量，詳細的機理尚待進一步深入研究。

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［2］武密山，趙素芝，任立中，等．川續斷皂苷VI誘導大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化的研究［J］．中國藥理學通報，2012，28(2):222-226.

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