雙黃連口服液抗炎作用的代謝組學(xué)研究

鄒忠杰， 龔夢(mèng)鵑， 王淑美， 梁生旺

(廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

代謝組學(xué) (Metabonomics)是近年來新興的一種“組學(xué)”技術(shù)，其主要是定量測(cè)定生物系統(tǒng)因病理生理或基因改變等刺激所致的動(dòng)態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答［1］。采用代謝組學(xué)方法一方面能夠獲取生物體在外界刺激影響下代謝狀態(tài)整體性的改變，另一方面可以利用代謝標(biāo)志物的變化推斷特定病理生理狀態(tài)下被調(diào)控的代謝途徑。代謝組學(xué)研究的整體性與中藥“多組分、多靶點(diǎn)”的作用模式相吻合，因此，代謝組學(xué)可能是科學(xué)闡釋中藥藥效與作用機(jī)制的重要途徑［2-3］。

角叉菜膠致大鼠足腫脹作為一種成熟的應(yīng)用最廣的非特異性炎癥模型，已廣泛應(yīng)用于抗炎藥物的篩選和藥效學(xué)評(píng)價(jià)等領(lǐng)域，常用藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)為大鼠足腫脹率等，但此指標(biāo)靈敏度較低，而且主觀因素影響較大［4］。雙黃連口服液由金銀花、黃芩和連翹組成，具有疏風(fēng)解表、清熱解毒的功效，臨床上主要用于細(xì)菌和病毒引起的感冒、流感以及肺炎、氣管炎、扁桃體炎等癥［5］。雙黃連口服液對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹有明顯的抑制作用［6］，但其發(fā)揮抗炎作用的機(jī)制卻不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)使用核磁共振 (NMR)方法建立大鼠血清及尿液的代謝指紋譜，探討炎癥引起的機(jī)體代謝狀態(tài)的變化，進(jìn)而鑒定與炎癥相關(guān)的代謝標(biāo)志物，并通過比較雙黃連口服液干預(yù)下這些代謝物的變化情況，探討雙黃連口服液抗炎作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠 (SPF級(jí))，體質(zhì)量160～180 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(粵)2008-0002。

1.2 儀器與試劑 Bruker AVANCE III 500 MHz全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振譜儀 (BrukerBiospin，Rheinstetten，Germany);PV—200足趾容積測(cè)量?jī)x (成都泰盟科技有限公司);雙黃連口服液 (哈藥集團(tuán)三精制藥股份有限公司，批號(hào)11041004，10 mL/支);疊氮鈉 (NaN3)、氘水 (D2O)、角叉菜膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、給藥及血清、尿液收集 將15只雄性SD大鼠置于12 h光照和12 h黑暗環(huán)境 (溫度22℃，相對(duì)濕度50%)下自由飲食。飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、角叉菜膠炎癥模型組和雙黃連給藥組。給藥組大鼠按5 mL/kg(根據(jù)動(dòng)物與人體間的等效劑量換算確定)灌胃給予雙黃連口服液，每天1次，連續(xù)5 d，對(duì)照組和模型組給予等體積蒸餾水。末次給藥30 min后，模型組和給藥組大鼠用1.0%角叉菜膠100μL/只皮下注射于左后足跖部致炎，對(duì)照組皮下注射等體積生理鹽水。隨后，各組大鼠置于具有集尿器 (放于冰上)的代謝籠中收集12 h尿液，同時(shí)加入2%NaN3溶液0.5 mL做防腐劑，收集的尿液置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｄ蛞菏占瓿珊螅诖笫笱劭艉箪o脈叢取血3 mL，經(jīng)凝固 (4℃，60 min)后離心 (3 500 r/min，15 min，4℃)得到血清，置于－20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)，在造模前、造模后6 h和12 h測(cè)量腫脹足跖容積，計(jì)算各大鼠足跖腫脹度和腫脹抑制率。足跖腫脹度=［致炎后足跖容積 (mL)－致炎前足跖容積(mL)］/致炎前足跖容積 (mL);腫脹抑制率 =(模型組腫脹度－給藥組腫脹度)/模型組腫脹度×100%。

2.2 血清和尿液樣本預(yù)處理 參照課題組前期研究［7］報(bào)道的方法，血清:室溫解凍后，于5 mm NMR測(cè)試管中加入400μL血清，然后加入50μL磷酸緩沖液 (0.2 mol/L Na2HPO4－0.2 mol/L NaH2PO4，pH7.4)和50μL D2O(用于鎖場(chǎng))，振蕩混勻，待測(cè)。尿液:室溫解凍后，取200μL磷酸緩沖液 (0.2 mol/L Na2HPO4－0.2 mol/L NaH2PO4，pH7.4)加入到400μL尿液中，靜置20 min后離心(3 500 r/min，10min，4℃)，取500μL上清液加至5mm NMR測(cè)試管中，然后再加入50μLD2O(含有0.05%W/V TSP－d4)，振蕩混勻，待測(cè)。

2.3 血清和尿液代謝指紋譜的測(cè)試 實(shí)驗(yàn)溫度為298 K;對(duì)于水峰采用有預(yù)飽和的1D NOESY脈沖序列進(jìn)行抑制，對(duì)于血清中蛋白質(zhì)及脂蛋白較寬的共振信號(hào)采用Carr-Purcell-Meibom-Gill［CPMG，relaxation delay－90°－(τ－180°－τ)n-acquisition］脈沖序列進(jìn)行抑制;總的回波時(shí)間2nτ=100 ms;為使采樣后的磁化矢量完全恢復(fù)到熱平衡態(tài)，弛豫延遲時(shí)間為4 s;譜寬10 kHz;采樣點(diǎn)數(shù)64 K;采集次數(shù)128次;傅立葉變換中線寬因子為0.3 Hz。在軟件 MestReNova 6.1(Mestrelab Research S．L，Santiago de Compostela，Spain)中手動(dòng)對(duì)所獲譜圖進(jìn)行相位和基線校正，然后進(jìn)行化學(xué)位移的定標(biāo)，血清和尿液樣品分別參照乳酸的甲基共振雙重峰(δ 1.33)和 TSP(δ0.0)［7］。

2.4 數(shù)據(jù)分析 按δ0.02等間隔在δ0.5～9.5區(qū)域分段積分，將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成ASCⅡ文件輸出到Excel 2007(Microsoft Inc．，Bellevue，WA)中進(jìn)行下一步處理［7］。對(duì)于血清和尿液樣品，為了消除飽和水峰時(shí)引起的譜線差異及消除由于尿素與溶劑交換質(zhì)子后發(fā)生的部分飽和轉(zhuǎn)移所造成的尿素信號(hào)差異，分別將區(qū)域δ4.74～5.22和δ4.50～5.98設(shè)為0積分段。各分段積分值進(jìn)行歸一化處理后乘以10 000導(dǎo)入 SIMCA-P 12.0(Umetrics AB，Umea，Sweden)，進(jìn)行主成分分析 (PCA)及正交偏最小二乘判別分析 (OPLS-DA)前，數(shù)據(jù)要經(jīng)過 Pareto標(biāo)度化處理［7］。

3 結(jié)果

3.1 雙黃連口服液對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響 見表1，大鼠連續(xù)給藥5 d后，雙黃連口服液對(duì)角叉菜膠所致大鼠足腫脹有較好的抑制作用，與模型組相比有顯著性差異。

表1 雙黃連口服液對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響Tab.1 Effect of Shuanghuanglian Oral Liquid on carrageenan-induced hind paw oedema in rats

3.2 血清和尿液的1H-NMR代謝物譜分析 如圖1所示，血清和尿液中的代謝物主要是氨基酸類、有機(jī)酸類和酮體等物質(zhì)，除此之外，血清中還含有大量的脂蛋白和脂類物質(zhì)。

3.3 角叉菜膠致炎后大鼠機(jī)體代謝指紋譜的變化大鼠血清和尿液所含成分非常復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)使用多變量統(tǒng)計(jì)分析中的正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)法對(duì)對(duì)照組和模型組大鼠的代謝指紋譜進(jìn)行比較。如圖2所示，兩組大鼠的血清和尿液樣本點(diǎn)在PC1維可以完全區(qū)分開，說明角叉菜膠致炎后大鼠機(jī)體生理及物質(zhì)代謝狀況已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變。本實(shí)驗(yàn)采用7倍交叉驗(yàn)證法對(duì)OPLS-DA模型的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證，主要參數(shù)如下，血清:R2X(cum)=0.82，R2Y(cum)=0.895，Q2(cum)=0.866;尿液:R2X(cum)=0.726，R2Y(cum)=0.874，Q2(cum)=0.831。從上述參數(shù)可以看出本研究建立的模型具有較高的可靠性。

圖1 對(duì)照組大鼠血清 (A)和尿液 (B)1 H-NMR圖Fig．1 Representative 1 H-NMR spectra of rat serum(A)and urine(B)samp les from the control group

圖2 對(duì)照組 (●)和模型組 (▲)大鼠血清 (A)和尿液 (B)OPLS-DA得分圖Fig．2 OPLS-DA score p lots derived from 1 H-NMR spectra of serum(A)and urine(B)sam ples in control group(●)and model group(▲)

3.4 與炎癥相關(guān)的代謝標(biāo)志物鑒定 首先選取OPLS-DA模型中變量重要性投影 (Variable importance in the projection，VIP)＞1的差異變量，然后再利用t檢驗(yàn) (P＜0.05)對(duì)篩選到的差異變量進(jìn)行驗(yàn)證，最終在血清和尿液中分別篩選得到12種和10種與炎癥相關(guān)的代謝標(biāo)志物，結(jié)果見表2、表3。

3.5 雙黃連口服液對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹的干預(yù)作用 藥理研究結(jié)果表明，雙黃連口服液對(duì)角叉菜膠致大鼠足腫脹有明顯抑制作用。從大鼠血清和尿液樣本代謝指紋的主成分分析 (PCA)(見圖3)，給藥組樣本點(diǎn)與模型組樣本點(diǎn)可以完全分離，且與對(duì)照組樣本點(diǎn)接近。綜合這兩個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出雙黃連口服液有效地干預(yù)了炎癥模型大鼠的生理及代謝狀況。

4 討論

血清和尿液中通常包含眾多的代謝產(chǎn)物，NMR的技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于可以對(duì)所有代謝產(chǎn)物同時(shí)測(cè)定，并且代謝產(chǎn)物的化學(xué)位移具有非常高的重現(xiàn)性。本實(shí)驗(yàn)中代謝物譜峰的歸屬主要是依據(jù)化學(xué)位移值、峰的裂分情況、耦合常數(shù)及參考文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)［8-9］，同時(shí)借助于軟件 Chenomx NMR Suite 7.1(Chenomx，Inc．，Edmonton，Alberta，Canada)中代謝產(chǎn)物的自動(dòng)解析功能。

表2 與炎癥相關(guān)的大鼠血清生物標(biāo)志物Tab.2 Biomarkers associated w ith inflammation in rat serum

表3 與炎癥相關(guān)的大鼠尿液生物標(biāo)志物Tab.3 Biomarkers associated w ith inflammation in rat urine

圖3 對(duì)照組 (●)、模型組 (▲)和給藥組 (■)大鼠血清 (A)和尿液 (B)PCA得分圖Fig.3 PCA score plots derived from 1 H-NMR spectra of serum(A)and urine(B)samples in control group(●)，model group(▲)and Shuanghuanglian Oral Liquid treatment group(■)

從表2和表3可以看出，模型組血清中葡萄糖水平下降而丙酮酸和乳酸水平升高，同時(shí)，與三羧酸循環(huán)相關(guān)的代謝產(chǎn)物的量升高，如尿液中的檸檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酸，這是機(jī)體糖代謝加速的表現(xiàn)，急性炎癥期機(jī)體最明顯的表現(xiàn)是紅、腫、熱、痛和功能障礙，其中涉及大量的炎癥因子的釋放，對(duì)能量的需求大大增加。給藥組中雙黃連口服液可以使血清中葡萄糖水平升高、乳酸水平下降，同時(shí)使尿液中檸檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酸水平下降，這說明其有效地干預(yù)了機(jī)體的糖代謝失衡。機(jī)體對(duì)能量需求增加還表現(xiàn)在模型組血清中低/極低脂密度蛋白及脂肪酸水平下降，由于供能需求，脂肪的轉(zhuǎn)運(yùn)、分解和β-氧化作用等過程被加速。酮體是脂肪酸在肝臟中β-氧化后的中間代謝產(chǎn)物，是肝臟輸出能源的一種形式，模型組血清和尿液中的乙酰乙酸及尿液中的3-羥基丁酸和丙酮水平下降可能是機(jī)體脂質(zhì)代謝失調(diào)的一種表現(xiàn)。雙黃連口服液對(duì)脂質(zhì)代謝的作用表現(xiàn)在其對(duì)低/極低脂密度蛋白及酮體等的干預(yù)。磷脂是細(xì)胞膜和脂蛋白等的重要成分，炎癥時(shí)，機(jī)體分泌大量的磷脂酶A2，磷脂的水解導(dǎo)致了模型組血清中膽堿和多不飽和脂肪酸如花生四烯酸的升高，花生四烯酸是前列腺素和白三烯等炎癥因子的重要前體;同時(shí)，這也可能導(dǎo)致模型組血清中低/極低脂密度蛋白水平下降［10］。雙黃連口服液可以使血清中膽堿和多不飽和脂肪酸的水平下降，說明其有可能抑制了磷脂酶A2的活性，這與已報(bào)道的研究相符［11］。馬尿酸、氧化三甲胺和二甲胺均與腸道菌群的代謝有關(guān)，其水平的升高說明模型組腸道菌群受到一定同程度的影響［12］。雙黃連口服液可以調(diào)節(jié)腸道菌群。炎癥引起細(xì)胞損傷導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解加速，模型組血清中氨基酸升高［10］。雙黃連口服液對(duì)炎癥模型大鼠血清中升高的氨基酸水平不能進(jìn)行有效的逆轉(zhuǎn)，說明其不能阻止炎癥部位蛋白質(zhì)分解。

本實(shí)驗(yàn)采用基于NMR的代謝組學(xué)方法研究了角叉菜膠致炎后大鼠機(jī)體代謝表型的變化并鑒定了相關(guān)的代謝標(biāo)志物，通過雙黃連口服液對(duì)標(biāo)志物的調(diào)控作用探討了其抗炎機(jī)制。代謝組反映了各種生命活動(dòng)的“終點(diǎn)”信息，可從整體性的角度體現(xiàn)機(jī)體的變化，與傳統(tǒng)單一或孤立的藥效評(píng)價(jià)方法相比，代謝組學(xué)方法對(duì)闡釋具有“多成分、多靶點(diǎn)”作用特點(diǎn)的中藥及復(fù)方的藥效具有明顯的優(yōu)勢(shì)。

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