熱毒寧注射液中梔子苷的降解動力學研究

張慧杰， 任曉亮， 邱喜龍， 蕭 偉， 戚愛棣*

(1.天津中醫藥大學，天津300193;2.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇連云港222001;3.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 (籌)，江蘇連云港222001)

熱毒寧注射液是由梔子、青蒿、金銀花等制成的中藥復方制劑，具有清熱、疏風、解毒的功效，臨床用于上呼吸道感染 (外感風熱證)所致的高熱、微惡風寒、頭身痛、咳嗽、痰黃等癥及手足口病的治療，具有很好的臨床療效［1-4］。梔子苷是熱毒寧注射液的主要有效成分之一，也是梔子所含有的主要活性成分和指標性成分［5］，為環烯醚萜苷類化合物 (圖1)，具有抗炎、鎮痛、降血糖、抗腫瘤等藥理活性［6-7］。以梔子苷為活性成分的藥物具有廣泛應用，但是未見到梔子苷降解動力學研究的相關報道，本實驗就梔子苷對照品及熱毒寧注射液中梔子苷在不同pH、溫度下的降解動力學進行了相關研究［8-9］，為其保存和使用提供參考。

圖1 梔子苷結構Fig.1 The structure of geniposide

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters 600E-2487高效液相色譜系統(美國Waters公司);AX205分析天平 (瑞士METTLER TOLEDO公司);XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);恒溫水浴 (天津市泰斯特儀器有限公司);DELTA 320 pH計 (瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 材料 梔子苷對照品 (純度≥98%，江蘇康緣藥業股份有限公司，批號:110609)，熱毒寧注射液 (江蘇康緣藥業股份有限公司，批號:110601)，乙腈 (色譜純，美國Sigma公司)，甲酸 (色譜純，美國Tedia公司)，甲醇 (天津市康科德科技有限公司)，超純水 (Millipore超純水凈化系統制得)，75%醫用酒精;磷酸二氫鈉、磷酸、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1 梔子苷測定方法［10-12］

2.1.1 色譜條件 Waters Symmetry ShieldTMRP18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5μm);流動相為0.3%甲酸溶液 (A)－乙腈 (B)(梯度洗脫，見表1);體積流量1 mL/min;柱溫為室溫;檢測波長為235 nm;進樣量10μL。

表1 HPLC梯度洗脫程序Tab.1 The gradient elution

2.1.2 線性關系的考察 精密稱取梔子苷對照品適量，加甲醇稀釋成含梔子苷質量濃度分別為1、2.5、5、10、20、40、50μg/mL的溶液。分別吸取10μL進樣，記錄色譜峰面積。以梔子苷質量濃度 (C)為橫坐標，峰面積 (A)為縱坐標繪制標準曲線，回歸方程為 A=20 672 659.44C+2 968.04，r=1.000。結果表明，梔子苷在1.0～50μg/mL范圍內線性關系良好。其色譜圖見圖2。

圖2 梔子苷降解色譜圖比較Fig.2 Chromatogram s of geniposide and sam ples

2.1.3 精密度 取2.1.2項下質量濃度為20μg/mL的溶液，重復進樣6次，記錄峰面積，計算得RSD值為0.60%。表明儀器及進樣精密度良好。

2.1.4 加樣回收率 精密稱取梔子苷對照品適量，置于10 mL棕色量瓶中，配制成18.3μg/mL的梔子苷溶液。分別吸取適量熱毒寧注射液及已配制的梔子苷溶液置10mL棕色量瓶中，渦旋混勻，以甲醇定容至刻度。取上述溶液10μL進HPLC測定，重復進樣6次，記錄峰面積，通過外標法計算，得平均加樣回收率為99.01%，RSD為1.5%。

2.2 梔子苷水溶液在不同環境下的穩定性研究

2.2.1 緩沖溶液的配制 取適量磷酸二氫鈉、磷酸及氫氧化鈉配制 pH值分別為 0.99、2.05、2.96、4.06、 5.09、 6.01、 6.94、 8.01、 9.06、9.87、11.06、12.02、12.88的一系列緩沖溶液。

2.2.2 貯備液的配制 將10 mL棕色量瓶滅菌后，稱取10.79 mg梔子苷，置于量瓶中，以純水定容，配制質量濃度為1.079 mg/mL的貯備液。

2.2.3 梔子苷在不同pH下的穩定性研究 移取250μL貯備液置于10 mL滅菌量瓶中，以一系列的緩沖溶劑定容，渦旋混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC法測定溶液中梔子苷的初始濃度 (c0)。

將樣品溶液密封并于室溫條件下放置，間隔一定的時間對樣品取樣，測定溶液中梔子苷的殘余濃度 (ct)。由不同時間梔子苷相對剩余濃度的對數［ln(ct/c0)］對時間 (t)作圖，見圖3。將測定結果進行擬合，擬合結果可得梔子苷的降解過程符合一級動力學，其相關動力學方程、線性相關系數(r)及降解速率常數 (k)見表2。pH與k值的關系見圖4。由圖4可知，梔子苷降解的整體趨勢是隨溶液堿性的增加，降解速率加快。

圖3 梔子苷水溶液在不同pH緩沖溶液中的降解曲線Fig.3 The relationship between the logarithms of residual content(ln c t/c0)for geniposide in aqueous solution under different pH

表2 梔子苷在不同pH緩沖溶液中的降解參數Tab.2 K inetic parameters for geniposide under different pH

圖4 梔子苷在不同pH緩沖溶液降解規律Fig.4 Degradation of geniposide under different pH

2.2.4 梔子苷在不同溫度下的穩定性研究 移取250μL貯備液置于10 mL滅菌量瓶中，以pH為7.27的超純水定容，渦旋混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC測定溶液中梔子苷的初始濃度 (c0)。

將樣品溶液密封，分別置于溫度為60、70、80、90℃的恒溫水浴鍋中，間隔一定的時間對樣品取樣，測定溶液中梔子苷的殘余濃度 (ct)。由不同時間梔子苷相對剩余濃度的對數 ［ln(ct/c0)］對時間(t)作圖，見圖5。將測定結果進行擬合，由擬合結果可知梔子苷在60、70、80、90℃下的降解過程均符合一級動力學，其相關動力學方程、線性相關系數 (r)、降解速率常數 (k)及溫度系數 (Q10)見表3。根據阿侖尼烏斯方程 ［見公式 (1)］，由各個溫度下的降解速率常數的對數ln k對絕對溫度的倒數1/T作圖，得圖6，擬合曲線的斜率為 (Ea/R)，經計算，pH值為7.27，溫度為60～90℃的條件下，梔子苷降解活化能Ea=128.08 kJ/mol。

圖5 梔子苷水溶液在不同溫度下的降解曲線Fig.5 The relationship between the logarithms of residual content(ln c t/c0)for geniposide in aqueous solution under different tem peratures

圖6 梔子苷降解速率 (ln k)與溫度 (1/T)之間的關系Fig.6 Relationship between lnk and 1/T

2.3 熱毒寧注射液中梔子苷在不同環境下的穩定性研究

2.3.1 熱毒寧注射液中梔子苷在不同pH下的穩定性研究 將10 mL棕色量瓶滅菌后，取500μL熱毒寧注射液，置于量瓶中，以一系列的緩沖溶劑定容，渦旋混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC測定溶液中梔子苷的初始濃度 (c0)。

按2.2.3項下方法對樣品進行測定，將測定結果進行擬合，擬合結果可得梔子苷的降解過程符合一級動力學 (圖7)，其降解動力學參數見表2。其中在pH1的環境下，梔子苷量基本保持不變，因此未在圖表中列中。pH與k值的關系見圖4，可以發現不同pH下，熱毒寧注射液中梔子苷與梔子苷對照品水溶液的降解趨勢一致。

圖7 熱毒寧注射液中梔子苷在不同pH緩沖溶液中的降解曲線Fig.7 Relationship between the logarithms of residual content(lnct/c0)for geniposide in Reduning Injection under different pH

2.3.2 熱毒寧注射液中梔子苷在不同溫度下的穩定性研究 將10 mL棕色量瓶滅菌后，取500μL熱毒寧注射液，置于量瓶中，以pH為7.27的超純水定容，渦旋混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC測定溶液中梔子苷的初始濃度 (c0)。

按2.2.4項下方法對樣品進行測定、擬合測定結果并計算降解動力學參數，表明熱毒寧注射液中梔子苷在60、70、80、90℃下的降解過程均符合一級動力學 (圖8)，其降解動力學參數見表3，經計算圖6，pH值為7.27，溫度為60～90℃的條件下，熱毒寧注射液中梔子苷降解活化能Ea=79.19 kJ/mol。

經多次平行的降解試驗，試驗數據趨勢基本一致。將水溶液及熱毒寧注射液中的梔子苷在不同pH條件下的降解速率常數進行配對t檢驗，結果顯示二者無顯著性差異 (P＞0.05)。由表2、表3可以看出，梔子苷對強堿及高溫比較敏感，無論在水溶液中還是在熱毒寧注射液中均較為穩定。

表3 梔子苷不同溫度下的降解參數Tab.3 Kinetic parameters for geniposide in different temperatures

圖8 熱毒寧注射液中梔子苷不同溫度下的降解曲線Fig.8 Relationship between the logarithms of residual content(ln c t/c0)for geniposide in Reduning Injection under different temperatures

3 討論

3.1 本實驗比較了兩種流動相系統，分別是乙腈-水和乙腈-甲酸水溶液，結果表明采用后一種流動相系統可以使注射液中的成分得到更好的分離，使峰形更好，經對 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%不同質量分數的甲酸水溶液的比較，發現采用0.3%、0.4%、0.5%甲酸水溶液時色譜峰分離情況及峰形相差不多，最終采用了乙腈－0.3%甲酸水溶液系統。熱毒寧注射液中成分較多，為使注射液成分完全分離，因此采用梯度洗脫的方法，首先采用了在0～20 min內將乙腈比例由5%增加至30%的方法，保留時間為11 min附近的峰分離度不能滿足要求，更改梯度后，乙腈在前5 min內由5%升至10%，且后面保持15%的比例，能使色譜峰的分離情況良好，綜合節省分析時間等因素，采用表1所示的梯度條件。

3.2 實驗結果表明，梔子苷的降解屬于一級動力學反應，不同pH環境下，根據梔子苷在不同pH下的反應常數趨勢，推測出梔子苷降解反應屬于堿催化。梔子苷是一種環烯醚萜苷類化合物，其結構中具有易分解的糖苷鍵和酯鍵，在堿性條件下易發生斷裂，而其結構中的羥基具有弱酸性，可以耐受酸性和弱堿性條件，故其降解趨勢具有圖4所顯示出的特征。梔子苷無論在水溶液中還是在熱毒寧注射液中均較為穩定，本試驗為梔子苷的使用、貯存及制劑研究提供了依據。通過梔子苷對照品與熱毒寧注射液中梔子苷的降解情況比較，可以看出制劑工藝未使梔子苷穩定性發生顯著性改變，其原因與輔料、制劑工藝等多種因素有關，有待深入研究。

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