黃芩總黃酮在Caco-2細胞上的吸收特征

張 蕾， 馮志強，， 陳孝健， 姚美村

(1.廣州中醫藥大學中藥學院，廣東廣州510006;2.中山大學藥學院，廣東廣州510080)

中藥有效成分口服吸收部位和機制的探討是提高中藥口服給藥生物利用度、研究開發其口服給藥制劑的基礎。現代藥理學表明，黃芩中的總黃酮是其藥理活性的主要藥效成分。現建立黃芩總黃酮胃腸道吸收機制的Caco-2細胞模型，以HPLC法測定黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素和千層紙素A的濃度，對黃芩總黃酮吸收機制進行初步研究。

Caco-2細胞模型 (Caco-2 cellmodel)來源于人類結腸腺癌組織，以普通的培養條件培養成熟的Caco-2細胞即可形成與小腸上皮細胞相同的細胞極性和致密的單細胞層組織，其形態和功能上與人體的小腸上皮細胞相似［1］。利用Caco-2細胞模型，可在體外進行藥物的攝取［2］、轉運［3-4］、代謝［5］等過程研究，是探索藥物吸收機制和高通量篩選的有效工具，并已被國內外廣泛用于研究各種活性物質體外吸收的各個環節。本研究運用Caco-2細胞模型，首次對黃芩總黃酮的吸收機制進行研究，為其制劑研究、口服給藥等提供信息。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SW-CJ-2F雙人雙面超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司;CO-150型CO2培養箱，NBS公司;Millicell-ERS跨膜電阻儀，Millipore公司;IX51型倒置顯微鏡，OLYMPUS公司;飛鴿高速離心機，上海安亭科學儀器廠;Precisa XS225A萬分之一分析天平;Dionex P680高效液相色譜儀，UVD170 U檢測器。

1.2 試藥 0.25%胰蛋白酶 －0.02%EDTA、DMEM培養基、青霉素和鏈霉素，Gibco公司;L-谷氨酰胺，MBCHEM公司;胎牛血清、非必需氨基酸，Hyclone公司;Hanks緩沖溶液 (HBSS，自制);黃芩苷對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:110715-200212)、漢黃芩素對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號:1514-200202);漢黃芩苷對照品 (西安融升生物科技有限公司，批號:091126，純度＞98%);千層紙素A(自制，純度＞98%);色譜乙腈 (Merk公司)。其余試劑為分析純。

1.3 材料 12孔Transwell細胞培養板、25 cm2卡式細胞培養瓶，Corning公司。

1.4 細胞 Caco-2細胞株，中國醫學科學院上海細胞庫 (原代來源于美國典型菌種保藏中心ATCC，American Type Culture Collection)實驗中，所用細胞代數為35～45代。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品貯備液 分別精密稱取黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素和千層紙素A對照品適量，用色譜甲醇配制成質量濃度分別為1 000、14.1、112、107μg/mL的對照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取黃芩總黃酮噴霧干燥粉末適量，用pH6.5的HBSS溶解并稀釋成400μg/mL，臨用前配制，用于Caco-2細胞轉運實驗。

2.2 分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 Phenomenex Luna C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流動相為乙腈 (A)－0.1%甲酸水 (B)梯度洗脫，程序為0→5 min，32%→35%A，5→15 min，35%→50%A，15→25 min，50%→50%A;體積流量1.0 mL/min;檢測波長275 nm;柱溫為室溫;進樣量20μL

2.2.2 專屬性試驗 分別進樣空白基質 ［在細胞轉運試驗給藥前，用HBSS緩沖液將Caco-2細胞沖洗3次，最后一次置于37℃培養箱溫孵30 min，然后收集腸腔側 (AP側)到基底側 (BL側)的溫孵液混合、混合對照溶液和供試品溶液以考察分析方法的專屬性。結果表明，各待測組分與相鄰色譜峰分離度良好，空白基質在相應保留時間處無雜質干擾。典型色譜圖見圖1。

2.2.3 線性關系考察 分別精密量取黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素和千層紙素A對照貯備液適量，用空白HBSS緩沖液配制成黃芩苷濃度為1.12、2.24、5.60、22.4、56.0、112μmol/L，漢黃芩苷濃度為 0.050 8、0.101 6、0.254、1.016、2.54、5.08μmol/L，漢黃芩素濃度為 0.134、0.268、0.67、2.68、6.7、13.4μmol/L，千層紙素A濃度為0.13、0.26、0.65、2.6、6.5、13.0μmol/L的混合系列對照品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，采用加權最小二乘法進行線性回歸，計算回歸方程，黃芩苷為y=28 667C－5 673(r=0.992 8);漢黃芩苷為y=46 964C+1 698(r=0.992 1);漢黃芩素為y=22 375C+468(r=0.997 9);千層紙素A為y=19 649C －469(r=0.998 4)。

2.2.4 準確度與精密度 用空白HBSS緩沖液以及空白基質分別配置低、中、高3個濃度的QC樣本，每一濃度進行3樣本分析，根據標準曲線計算QC樣本濃度，計算方法的精密度 (RSD)和準確度 (RE)，結果見表1。

圖1 典型色譜圖Fig.1 Typical HPLC chrom atogram s

表1 準確度和精密度試驗結果Tab.1 Results of accuracy and precision

2.3 Caco-2細胞轉運實驗

2.3.1 細胞培養［6-9］用DMEM完全培養液將復蘇后的Caco-2細胞培養在25 cm2卡式細胞培養瓶，置于37℃ 培養箱 (通入5%CO2，相對濕度在90%)中培養。隔天換液，當細胞融合度達到80%以上，用0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化液進行消化，按1∶3的比例傳代。取對數生長期的Caco-2細胞，調節密度為8×104～2×105個/cm2，接種0.5 mL到12孔Transwell板AP側，BL側則加入1.5 mL培養液。接種后一周內隔天換液，1周后每天換液，培養至21 d。檢測堿性磷酸酶活性和各孔跨膜電阻 (均大于500Ω/cm2)，細胞形成緊密單層后即可用于轉運實驗。

2.3.2 表觀滲透系數 (Papp)及表觀滲透率(PDR)的計算 表觀滲透系數 (apparent drug permeability coefficient，Papp)的計算公式為:

表觀滲透率 (滲透方向率，PDR)的計算公式為:

其中，PappB→A為受試藥物從BL到AP側的表觀滲透系數，PappA→B為受試藥物從AP到BL側的表觀滲透系數。

2.3.3 雙向轉運實驗 取符合轉運實驗的Transwell板，吸棄培養板中舊的培養液，加入37℃預熱的HBSS蕩洗3次，于最后一次置培養箱中溫孵30min后，收集空白基質，進行雙向轉運實驗。在AP→BL側的轉運實驗中，加0.5 mL供試品溶液到AP側作為供給池，1.5 mL的pH為7.4的空白HBSSBL側作為接收池;在BL→AP側轉運實驗中，則將1.5 mL藥物加到BL側作為供給池，0.5 mL空白HBSS到AP側作為接收池，置于培養箱中。分別于15、30、60、90、120、180 min從接收池吸取 100μL轉運液 (12 000 r/min離心5 min，取上清液)，同時用空白HBSS補足，每個時間點設3個平行孔。結果見圖2和表2。

圖2 時間對4個黃酮類成分轉運量AP→BL和BL→AP的影響 (n=3， ± s)Fig.2 Effect of time on Caco-2 cell transport of flavonoids from bidirection(n=3， ± s)

表2 4種黃酮類成分在Caco-2細胞中雙向轉運的P app值(n=3， ± s)Tab.2 P app value of flavonoids from bidirection(n=3， ± s)

表2 4種黃酮類成分在Caco-2細胞中雙向轉運的P app值(n=3， ± s)Tab.2 P app value of flavonoids from bidirection(n=3， ± s)

化合物 P app/(1×10－6 cm·s－1)P app A→B P app B→A PDR黃芩苷 1.65±0.38 1.23±0.24 0.75漢黃芩苷 1.58±0.21 1.22±0.16 0.77漢黃芩素 1.57±0.15 1.27±0.07 0.80千層紙素A 5.74±0.18 5.13±0.19 0.89

3 討論

3.1 在Caco-2細胞模型中，可以通過測定藥物不同濃度下在細胞內的轉運量、滲透系數Papp值以及表觀滲透率，而確定藥物的轉運機制。若藥物的轉運量隨濃度和時間的增加而增大，則提示該藥物以被動擴散為主要轉運機制;若表觀滲透率小于1.5，即AP→BL的Papp值與BL→AP的Papp值大致相同，兩者比值約為1，也可確定被動擴散為藥物的主要轉運機制;而若藥物的表觀滲透率大于1.5，則提示藥物可能存在主動轉運。另外，藥物的表觀滲透系數Papp值＞10－6cm/s，說明藥物的吸收良好;若Papp值 ＜10－7cm/s，則藥物的吸收較差 (吸收＜1%)。

3.2 本研究中，黃芩提取物總黃酮給藥Caco-2細胞單層后，4種黃酮類成分從AP側到BL側的表觀滲透系數 Papp值在1 ×10－6～6 ×10－6cm/s，說明藥物吸收良好;轉運量呈現一定的時間依賴性，且PDR值均約為1，提示4種黃酮類成分均以被動擴散為主要轉運機制，與小柴胡湯復方中黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、千層紙素A的被動轉運方式一致［10］。另外，黃芩苷單體給藥AP→BL的Papp值為0.664±0.103［11］，而本研究黃芩提取物中黃芩苷AP→BL 的 Papp為 (1.65 ±0.38) ×10－6cm/s，黃芩提取物中其它成分可促進黃芩苷的吸收;文獻［12］表明千層紙素A單體給藥AP→BL的Papp值與BL→AP的Papp值均為1×10－6cm/s(PDR值均約為0.79)，本研究黃芩提取物中千層紙素A AP→BL的 Papp值與 BL→AP的 Papp值均為5×10－6cm/s(PDR值均約為0.89)，由此可見，黃芩提取物中其它成分的存在亦促進了千層紙素A的吸收，但其作用并無方向性。

3.3 中藥黃芩在臨床上用途廣泛，并且在許多方劑中均有配伍使用，這就意味著它與其它配伍組分存在著廣泛的相互作用。利用Caco-2細胞單層模型來研究單體及整體給藥后主要藥效成分的腸吸收，為其在胃腸道介導的藥物相互作用的系統性深入研究等奠定了基礎。

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