HPLC法同時測定白芍、甘草藥對提取物中9種有效成分

李 妍， 楊燕云， 張振秋， 侯學智， 楊 超

(遼寧中醫藥大學，遼寧大連116600)

芍藥甘草湯系東漢張仲景《傷寒論·太陽篇》的著名方劑，是常用的緩急止痛之方，由白芍和炙甘草等組成，方中白芍與炙甘草配伍比例為1∶1，主營陰不足、肝脾不和，癥見脘腹諸痛，四肢攣急等證候。芍藥甘草湯總有效部位 (TPG)，由芍藥總苷、甘草總苷、甘草總黃酮3部分組成［1］。芍藥苷、芍藥內酯苷和苯甲酰芍藥苷等單萜類成分為白芍總苷的主要活性成分［2］，甘草苷、芹糖基甘草苷、芹糖基異甘草苷為甘草總苷的代表成分，甘草素、異甘草素為甘草黃酮的代表成分;此外，白芍所含1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖，甘草所含甘草酸亦具有明確的藥理活性［3-4］。

《中國藥典》2010年版 (一部)對白芍、甘草單味藥材中芍藥苷、甘草苷、甘草酸分別進行了定量測定［5］。現有文獻，多是以芍藥苷、甘草苷、甘草素、甘草酸為指標性成分進行的定量測定［1，6-9］，而上述其他藥理活性成分卻鮮有報道。因此本實驗從文獻報道的白芍甘草藥對提取物中有效成分出發建立了高效液相波長切換法，同時測定了芍藥內酯苷 (Ⅰ)、芍藥苷 (Ⅱ)、甘草苷(Ⅲ)、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖 (Ⅳ)、芹糖基異甘草苷 (Ⅴ)、異甘草苷 (Ⅵ)、苯甲酰芍藥苷 (Ⅶ)、甘草酸 (Ⅷ)、異甘草素 (Ⅸ)9個藥理活性成分，為更加全面的科學評價白芍甘草藥對提取物的質量奠定基礎。

1 儀器與試藥

Agilent-1100型高效液相色譜儀 (儀器編號:20041191 DE43607375)，配置四元梯度泵、在線脫氣機、VWD檢測器;AS3120A超聲提取器 (天津奧特賽恩斯儀器有限公司);2140型電子分析天平(上海奧豪斯公司)、METTLER AB135-S十萬分之一電子天平 (瑞士);U-3010型紫外-可見分光光度計 (日立公司)。

對照品甘草苷 (批號:111610-200604)購于中國食品藥品檢定研究所;異甘草素 (批號:20100603)、苯甲酰芍藥苷 (批號:20100513)均購于天津一方科技有限公司;芹糖基異甘草苷(批號:20101108)、異甘草苷 (批號:20100915)均購于上海永恒生物科技有限公司;甘草酸 (批號:20100730)、芍藥苷 (批號:20100821)均購于上海融禾科技有限公司;芍藥內酯苷 (批號:20100325)、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖(批號:20100706)均購于深圳美荷生物科技有限公司，純度均為98%。

本研究所用的白芍飲片、炙甘草飲片均購于河北安國，經遼寧中醫藥大學李峰教授鑒定分別為芍藥Paeonia lactiflora Pall．的干燥根、甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch．的干燥根及根莖。

藥對提取物制備 取白芍、炙甘草中粉1∶1，100 g，8倍量水煎煮2次，每次60 min，濾過，合并濾液濃縮，于70℃減壓干燥至恒定質量，即得。

乙腈、甲醇為色譜純 (山東禹王化學試劑公司)，水為重蒸餾水，磷酸、三氯甲烷為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取9個對照品適量，分別加甲醇制成芍藥內酯苷質量濃度為0.058 89 mg/mL、芍藥苷質量濃度為0.081 50 mg/mL、甘草苷質量濃度為0.067 91 mg/mL、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖質量濃度為0.064 38 mg/mL、芹糖異甘草苷質量濃度為0.076 47 mg/mL、異甘草苷質量濃度為0.062 28mg/mL、苯甲酰芍藥苷質量濃度為0.072 67 mg/mL、甘草酸質量濃度為0.098 91 mg/mL、異甘草素質量濃度為0.061 25 mg/mL的單一對照品貯備液，備用。依次精密量取上述9個對照品貯備液0.95、2.25、1.10、0.20、0.95、0.35、0.30、2.30、0.02 mL，置同一25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1mL芍藥內酯苷2.238μg、芍藥苷7.335μg、甘草苷2.988 μg、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖0.515μg、芹糖異甘草苷2.906μg、異甘草苷0.872 μg、苯甲酰芍藥苷0.491μg、甘草酸9.100μg、異甘草素0.049μg的混合溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 取藥對提取物0.1 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入水25 mL，密塞，稱定質量，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用水補足損失的質量，搖勻;精密移取續濾液10mL于分液漏斗中，加入乙腈20 mL，三氯甲烷20 mL，靜置分層，將水層全部取出至10 mL量瓶，加水至刻線，搖勻;0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件 Dikma Technologies-C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5μm);流動相:乙腈 (A)-0.1%磷酸水 (B)，梯度洗脫 (0～5 min，5%A→10%A;5～10 min，10%A→12%A;10～15 min，12%A→14%A;15～20 min，14%A→16%A;20～25min，16%A→18%A;25～30 min，18%A→20%A;30～40 min，20%A→25%A;40～50 min，25%A→40%A;50～62 min，40%A→55%A;62～72 min，55%A→70%A;72～85 min，70%A→55%A;85～95 min，55%A→5%A)，體積流量 1.0 mL/min，檢測波長為267 nm(0～13min)、258 nm(13～17min)、230 nm(17～27min)、276 nm(27～42 min)、360 nm(42～46 min)、276 nm(46～50 min)、230 nm(50～53 min)、275 nm(53～55 min)、250 nm(55～95 min);柱溫30℃;進樣量20μL。在上述色譜條件下，以甘草酸計算理論塔板數大于300 000，分離度大于1.5。對照品、樣品以及2種藥材的陰性色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A)、樣品(B)、白芍陰性液(C)、炙甘草陰性液(D)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms ofm ixed reference substance(A)、samp le(B)、negative sample w ithout Paeoniae Radix alba(C)、negative sample w ithout Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(D)

2.3 線性關系的考察 分別精密量取上述混合對照品溶液2、5、10、15、20μL注入高效液相色譜儀，測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程，結果見表1。

表1 9個成分的標準曲線方程、相關系數和線性范圍Tab.1 Regression equations，correlation coefficients，and linear ranges of nine constituents

2.4 精密度試驗 精密吸取供試品溶液20μL，按2.2項下色譜條件連續進樣5次，測得1～9峰面積的 RSD(n=5)分別為 2.0%、1.6%、2.3%、1.6%、1.6%、2.1%、1.8%、1.8%、2.1%。結果表明，儀器精密度較好。

2.5 重復性試驗 精密稱取藥對提取物0.1 g，共6份。按2.1.3項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣20μL，測得芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸、異甘草素平均質量分數 (n=6)分別為8.755、 33.82、 13.95、 1.258、 8.005、 1.766、2.344、51.40、0.135 4 mg/g;RSD分別為1.2%、1.6%、1.9%、1.5%、1.3%、1.6%、1.8%、2.0%、1.7%。

2.6 穩定性試驗 取供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣20μL分析，測定峰面積。1～9峰面積的RSD(n=7)分別 為 1.3%、1.7%、1.6%、 1.7%、1.9%、1.1%、1.2%、1.9%、1.7%。結果表明，供試品溶液中9個化合物在24 h內穩定。

2.7 加樣回收率試驗 取已知含有量 (芍藥內酯苷、芍藥苷、甘草苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖、芹糖基異甘草苷、異甘草苷、苯甲酰芍藥苷、甘草酸、異甘草素質量分數分別為8.755、33.82、 13.95、 1.258、 8.005、 1.766、 2.344、51.40、0.135 4 mg/g的提取物5份，每份約0.05 g，精密稱定。依次精密移取上述單一對照品貯備液 0.85、2.35、1.20、0.10、0.60、0.15、0.20、2.95、0.013 mL，置同一50 mL具塞錐形瓶中，按2.1.2項下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進行測定，計算回收率。結果上述成分的平均回收率 (n=5)分別為98.5%、103.4%、102.7%、98.2%、96.4%、96.3%、102.7%、102.6%、96.4%;RSD分別為 2.5%、2.0%、1.1%、2.3%、1.3%、1.4%、2.0%、1.7%、1.2%。見表2。

2.8 樣品測定 取3批白芍、炙甘草1∶1藥對提取物0.1 g，精密稱定。按2.1.2項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進樣測定，精密吸取供試品溶液20μL，分別注入液相色譜儀，在記錄色譜圖并以外標法計算樣品中9個指標成分的質量分數，結果見表3。

表2 9個成分回收率考察Tab.2 Results of recovery tests of nine constituents

3 討論

3.1 本實驗以芍藥苷、甘草酸為評價指標，經考察回流提取2 h和超聲提取30 min提取方式發現，回流提取與超聲提取結果差別不大，超聲提取簡單方便，故采用超聲提取法。又考察了甲醇、乙醇、水3種提取溶劑發現水的提取效果最好。采用L9(34)正交試驗法，選擇溶劑量、提取次數、提取時間3個因素，進行3水平考察。采用綜合評分法進行數據分析 (權重系數為0.5)。最終確定最佳提取工藝為水提取1次，每次30 min。

表3 9種指標成分測定結果(n=4)Tab.3 Analytical results of nine constituents(n=4)

3.2 在2.4項線性關系的考察中，按標準曲線的最小進樣量進樣時，信噪比均大于30，可用于準確定量。

3.3 依據有關文獻［10-12］，本實驗建立了HPLC波長切換方法，測定了白芍甘草藥對中9個有效成分的量，以保證各成分在檢測波長處有最大吸收。芍藥內酯苷的最大吸收波長在300 nm，但由于芍藥內酯苷和芍藥苷保留時間比較接近，如果切換波長會導致基線嚴重漂移，所以芍藥內酯苷的檢測波長選擇了230 nm，沒有在最大波長處檢測。同樣，異甘草素的最大吸收波長在370 nm，異甘草素和甘草酸的保留時間比較接近，因此異甘草素的檢測波長選擇了250 nm，其他各成分均在其最大吸收波長處檢測。9個成分的具體檢測波長如下:芍藥內酯苷、芍藥苷為230 nm;甘草苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖為276 nm;芹糖基異甘草苷、異甘草苷為360 nm;苯甲酰芍藥苷為230 nm;甘草酸、異甘草素為250 nm。

3.4 采用本研究建立的方法對3批白芍甘草藥對提取物中9個指標成分進行了定量測定。結果表明，9個指標性成分之間含有量差別不大，芍藥內酯苷的質量分數8.687～8.722 mg/g、芍藥苷的質量分數33.25～33.80 mg/g、甘草苷的質量分數13.69 ～ 13.78 mg/g、1，2，3，4，6-五沒食子酰葡萄糖的質量分數1.261～1.266 mg/g、芹糖異甘草苷的質量分數7.951～7.986 mg/g、異甘草苷的質量分數1.765～1.778 mg/g、苯甲酰芍藥苷的質量分數2.291～2.322 mg/g、甘草酸的質量分數51.06～51.55 mg/g、異甘草素的質量分數0.134 0～0.135 4 mg/g。本實驗立足芍藥甘草湯方中重要的藥理有效成分，建立波長切換HPLC法同時測定了白芍炙甘草藥對提取物中9個有效成分，方法簡便、快捷、重復性好，在該藥對的定量測定方面具有一定的創新性，可為全面的科學評價芍藥甘草湯質量提供依據。

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