銀翹散對呼吸道黏膜Th1/Th2細胞因子的影響

王 強， 劉亞歐， 李興平

(四川省中醫藥科學院，四川成都610041)

銀翹散作為辛涼解表法的代表方之一，臨床對外感風熱表證相關疾病確有療效，現代藥理學雖然從解熱鎮痛、抗炎、抗病原微生物以及免疫功能調節等多個方面對其作用機制進行了廣泛而深入的系統研究，但仍有諸多令人困惑的地方。從大量的歷史研究文獻中發現，包括銀翹散在內的中藥制劑的藥理作用與解熱鎮痛抗炎、抗病原微生物、免疫調節等相關化學藥物的作用強度差距甚遠，而與此對應的是中藥制劑臨床療效的廣泛認同;化學藥物臨床病癥的反復遷延。對此類諸多問題，現有研究成果似難以作出合理的解釋。這是否提示，辛涼解表方藥應存在我們尚未認識到的作用路徑。本實驗以銀翹散為工具方，試圖從黏膜免疫平衡的角度對辛溫解表法的作用機制進行探索性的闡釋。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 銀翹散:《溫病條辨》原方 (連翹、金銀花各15 g，桔梗、薄荷各9 g，竹葉、生甘草各5 g，荊芥穗、淡豆豉、牛蒡子各6 g)。參考《中醫方劑大辭典》、《方劑學》劑量及制備方法。根據《中藥藥理研究方法學》按照體表面積換算，自煎。玉屏風顆粒，批號20101005，5 g/袋，廣東環球制藥有限公司提供。利巴韋林片，批號100204，20 mg/片，四川美大康藥業股份有限公司提供。

1.2 動物 KM種小鼠，雌雄各半，體質量 (20±2)g，SPF級，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心供應，合格證:SCXK(川2010-19)。清潔級動物實驗環境，溫度為(20±2)℃;照明條件為明暗各12 h;濕度為55% ～65%。

1.3 流感病毒 甲l型流感病毒FM1鼠肺適應株由四川大學華西醫學院微生物教研室提供，雞胚尿囊腔接種，制備新鮮毒種，測血凝滴度1:256，低溫－70℃凍存備用。

1.4 試劑和儀器 小鼠sIgA、IL-4、IFN-γELISA試劑盒，購自深圳晶美生物工程有限公司。臺式高速冷凍離心機，德國Heraeus公司產品。酶標儀，Diareader ELX800C，Dialab。

1.5 方法

1.5.1 對正常鼠支氣管肺泡灌洗液IL-4、IFN-γ的影響將小鼠按體質量隨機分為5組，每組10只:銀翹散10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg劑量組，空白對照組，陽性對照組(玉屏風顆粒，30 g/kg)，灌胃給予試驗藥物或等體積生理鹽水 (0.1 mL/10 g)，1次/日，連續3 d，末次給藥2 h后脫頸椎處死小鼠，暴露氣管，從喉頭處用自制針管行氣管插管，慢速推注37℃ 預溫的生理鹽水1.5 mL，回抽，重復2次，離心，取上清液，ELISA方法檢測IL-4、IFN-γ水平，計算IFN-γ/IL-4比值。

1.5.2 對免疫抑制鼠支氣管肺泡灌洗液IL-4、IFN-γ的影響 將小鼠按體質量隨機分為6組，每組10只:銀翹散10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg劑量組，正常對照組、模型對照組、陽性對照組 (玉屏風顆粒，30 g/kg)，除正常對照組外，其余各組環磷酰胺100 mg/kg腹腔注射造成免疫功能低下模型。同時給予試驗藥物或等體積生理鹽水 (0.1 mL/10 g)，1次/日，連續3 d，末次給藥2 h后脫頸椎處死小鼠，暴露氣管，從喉頭處用自制針管行氣管插管，慢速推注37℃預溫的生理鹽水1.5 m L，回抽，重復2次，離心，取上清液，ELISA方法檢測IL-4、IFN-γ水平，計算IFN-γ/IL-4比值。

1.5.3 對流感病毒感染鼠支氣管肺泡灌洗液sIgA、IL-4、IFN-γ的影響 將小鼠按體質量隨機分為6組，每組10只:銀翹散10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg劑量組，正常對照組、模型對照組、陽性對照組 (利巴韋林，0.05 g/kg)。試驗動物在乙醚輕度麻醉下鼻腔感染接種甲l型流感病毒FM1鼠肺適應株，0.2 mL/只，感染后0.5 h灌胃給予藥物或等體積生理鹽水 (0.1 m L/10g)，1次/日，連續3 d，末次給藥2 h后脫頸椎處死小鼠，暴露氣管，從喉頭處用自制針管行氣管插管，慢速推注37℃ 預溫的生理鹽水1.5 mL，回抽，重復2次，離心，取上清液，用ELISA方法檢測sI-gA、IL-4、IFN-γ水平，計算IFN-γ/IL-4比值。

2 結果

2.1 對正常鼠BALF中IL-4、IFN-γ的影響 與正常對照組相比較，銀翹散各劑量組連續給藥3 d，對正常鼠IFN-γ、IL-4的水平及IFN-γ/IL-4比值無明顯影響，結果見表1。

表1 對正常鼠BALF中IL-4、IFN-γ的影響 ( ± s)

表1 對正常鼠BALF中IL-4、IFN-γ的影響 ( ± s)

注:與正常對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。下同。

組別 劑量/(g·kg－1)IFN-γ/(pg·mL－1)IL-4/(pg·mL－1)IFN-γ/IL-4正常對照組89.25±26.14 12.23±2.03 8.14±1.45銀翹散組 10 79.88±24.27 12.45±3.67 7.82±1.04銀翹散組 20 88.26±20.41 13.07±2.69 7.67±1.43銀翹散組 40 77.34±16.95 12.13±3.02 7.84±1.52玉屏風顆粒組30 83.69±26.30 13.33±3.27 7.59±1.66

2.2 對免疫抑制鼠BALF中IL-4、IFN-γ的影響 與模型對照組相比較，銀翹散各劑量組連續給藥3 d，對免疫抑制鼠IFN-γ、IL-4的水平及IFN-γ/IL-4比值無明顯影響，結果見表2。

表2 對免疫抑制鼠BALF中IL-4、IFN-γ的影響 ( ± s)

表2 對免疫抑制鼠BALF中IL-4、IFN-γ的影響 ( ± s)

組別 劑量(g·kg－1)IFN-γ/(pg·mL－1)IL-4/(pg·mL－1)IFN-γ/IL-4正常對照組 － 87.21±24.07＊＊13.61±3.42＊＊6.87±1.34模型對照組 － 56.38±17.50 8.35±1.87 7.36±1.89銀翹散組 10 49.34±15.27 8.20±1.59 7.01±1.11銀翹散組 20 48.17±16.35 7.98±1.36 6.72±1.38銀翹散組 40 47.62±14.29 8.02±1.74 6.56±1.62玉屏風顆粒組 30 69.47±23.51*10.65±1.52*6.79±1.73

2.3 對流感病毒感染鼠BALF中sIgA、IL-4、IFN-γ的影響 銀翹散40 g/kg灌胃給藥，連續3 d可增加流感病毒感染鼠BALF中sIgA的水平，20 g/kg、40 g/kg劑量組對增高的IFN-γ及IFN-γ/IL-4比值有降低作用，見表3。

表3 對流感病毒感染鼠BALF中sIgA、IL-4、IFN-γ的影響 ( ± s)

表3 對流感病毒感染鼠BALF中sIgA、IL-4、IFN-γ的影響 ( ± s)

組別 劑量/(g·kg－1) sIgA/(μg·mL－1) IFN-γ/(pg·mL－1) IL-4/(pg·mL－1) IFN-γ/IL-4正常對照組 － 0.17±0.03* 79.34±23.39* 14.61±3.86* 5.69±1.36＊＊模型對照組 － 0.22±0.04 95.41±20.07 12.09±2.06 8.26±2.53銀翹散組 10 0.24±0.05 89.56±19.78 11.57±2.14 7.94±2.12銀翹散組 20 0.26±0.06 80.26±17.51* 10.79±1.89 7.51±1.96*銀翹散組 40 0.31±0.07* 76.32±16.66* 11.85±1.92 6.93±1.67*利巴韋林組 0.05 0.18±0.04 92.07±21.35 11.97±1.64 8.04±2.17

3 討論

銀翹散為辛涼解表經典方之一，是清代醫家吳鞠通根據《內經》 “風淫于內，治以辛涼，佐以苦;熱淫于內，治以咸寒，佐以甘苦”的理論創制而成，由金銀花、連翹、桔梗、薄荷、淡竹葉、甘草、荊芥、淡豆豉、牛蒡子等九味藥組成，現主要用于治療流行性感冒、急性扁桃體炎、大葉性肺炎等表證相關疾病的防治。上世紀七、八十年代至今，基于臨床應用，對其作用機制的研究也集中于解熱鎮痛抗炎、抗病源微生物以及免疫干預等多個方面。尤其是針對免疫干預作用，做了大量細致、深入的工作，但同時我們也看到了許多不同甚或矛盾的結果。早期有研究報道銀翹散灌胃不能增強網狀內皮系統對血中惰性碳粒的吞噬廓清能力［1］，對天花粉所致大鼠和小鼠皮膚被動過敏反應均有明顯抑制作用［2］。但近年也有銀翹散可增強免疫抑制鼠網狀內皮系統吞噬功能的報道［3-4］，新近研究表明，銀翹散可顯著提高免疫抑制鼠外周血中CD4+T細胞的數量，增加免疫抑制鼠胸腺和脾臟質量［5］。因此，如何認識解表方藥免疫干預作用的科學實質是擺在我們面前的現實課題。

1989年Mossman根據Th細胞分泌細胞因子的不同將其分為兩個功能群Th1和Th2［6］，它們通過相互誘生、相互調控、受體表達以及生物學效應的相互影響 (增強與拮抗)，組成了免疫微環境中的特殊細胞因子網絡 (cytokines network)，其各自的表達水平是保證整個細胞免疫網絡系統平衡的關鍵。Thl主要分泌IL-2和IFN-γ，介導細胞免疫應答，反應炎癥的損害程度;Th2主要分泌IL-4，5，6，9，10，13，介導的體液免疫應答，與疾病的進展、慢性化有關［7-9］。其中，IL-4和IFN-γ是一對相互拮抗的細胞因子，為反映Thl和Th2細胞亞群平衡的重要標志。在機體免疫應答過程中，Th1細胞通過大量增殖及其釋放的標志性細胞因子可抑制Th2細胞增殖及其介導的免疫效應，反之亦然。常態下機體內的Th1/Th2細胞比例保持著相對平衡狀態。在不同抗原誘導的免疫應答過程中，Th1/Th2某一亞群功能增強，另一亞群功能擇受到抑制，出現免疫偏移 (immune deviation)，與哮喘［10］、肺炎［11］、流感［12］等多種呼吸道疾病的發生有著密切的關系。而前期實驗也已發現辛溫解表類方藥對模型動物BALF中sIgA水平、CD+4、CD+8T細胞數量有著趨勢性的調節作用［13-14］。這或許為我們研究銀翹散的免疫干預機制提供了新的契機。本實驗表明流感病毒感染鼠IL-4水平降低，IFN-γ水平升高，IFN-γ/IL-4b比例升高，提示模型動物BALF中細胞因子分泌失衡，Thl應答占優勢，此與機體的免疫防御機制有關，有利于病源微生物的清除。但 IL-4水平降低，失去對 IFN-γ的拮抗作用，IFN-γ/IL-4b比例升高，導致機體的免疫炎癥損傷。本試驗數據表明銀翹散能使模型鼠增高的IFN-γ水平及IFN-γ/IL-4比值降低，逆轉Thl/Th2的失衡，減少機體的免疫炎癥損傷，增加sIgA分泌，從而減輕氣道炎癥，清除病原體。但其對Th1/Th2免疫平衡的干預環節和機制尚有許多未解之處，有待進一步研究。

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