枇杷花醇提物止咳化痰作用實驗研究

陳曉芳， 張 倩， 吳文倩， 劉春宇

(蘇州大學醫學部藥學院，江蘇蘇州215123)

枇杷Eriobotrya japonica(Thunb．)Lindl為薔薇科植物，藥用歷史悠久，具有化痰止咳、和胃降氣之功效，作為傳統中藥，枇杷的研究集中于葉和果實，對枇杷花的相關研究相對較少，枇杷花氣味香醇獨特，性溫，可入肺散寒，化痰止咳，潤肺下氣［1-2］。目前，雖有枇杷花止咳方面的藥效研究，但對其作用機制及藥效物質基礎的研究未見報道。另外，枇杷樹在花期進行疏花以提高枇杷品質，而疏掉的花蕾大多沒有充分利用。為了進一步開發利用枇杷花的資源，課題組對枇杷花的止咳化痰藥理作用及藥效物質基礎進行了系統研究，本實驗采用多種動物模型觀察了枇杷花醇提物的止咳化痰作用，并初步探討了其作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 電子天平 (EL303梅特勒-托力多儀器);超聲霧化器WH-802型(廣東粵華醫療器械廠);小鼠/豚鼠玻璃容器(自制);RE-52A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);DZF-6050真空干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 實驗動物 昆明種小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g;豚鼠，雌雄兼用，體質量150～190 g，均由蘇州大學醫學部實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證SCXK(蘇)2007—0007，實驗動物使用許可證SYXK(蘇)2007—0035。

1.3 材料

枇杷花:采于蘇州東山，經本院生藥教研室劉春宇教授鑒定為枇杷Eriobotrya japonica(Thunb．)Lindl的花，干燥后備用。

枇杷花醇提物:取枇杷花粉末1000 g，加10倍量95%乙醇，60℃，回流提取2.5 h，過濾，重復2次，合并濾液，濃縮得浸膏，給藥劑量以相當于原藥材質量計算。豚鼠灌胃劑量:枇杷花醇提物高劑量組 (3 g/kg)，枇杷花醇提物中劑量組 (1.5 g/kg)，枇杷花醇提物低劑量組 (0.75 g/kg);小鼠灌胃劑量:枇杷花醇提物高劑量組 (4 g/kg)，枇杷花醇提物中劑量組 (2 g/kg)，枇杷花醇提物低劑量組(1 g/kg)。

念慈庵蜜煉川貝枇杷膏 (香港京都念慈總廠有限公司，批號:Y3808010);P物質試劑盒(R＆D分裝);其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 對氨水引咳小鼠的影響 采用小鼠氨水引咳法［4］，預實驗用氨水引咳法篩選一批體質量18～22 g的昆明小鼠，3 min內不發生咳嗽的小鼠不予選用，待小鼠穩定2 d后，取合格小鼠50只，雌雄各半，按體質量隨機分為5組，對照組 (生理鹽水)、念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 (5.4 g/kg)、枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組，連續給藥7 d，小鼠每次灌胃0.2 mL/10 g溶液，末次給藥前禁食不禁水12 h，于末次給藥1 h后，將小鼠置于自制密閉玻璃容器中，超聲霧化器噴入氨水20 s后，立即取出小鼠，記錄小鼠咳嗽潛伏時間和3 min內咳嗽次數。

2.2 對枸櫞酸引咳［3］豚鼠的影響 預實驗，將豚鼠放入自制密閉玻璃容器內，待其在容器內穩定1 min后，用超聲波霧化吸入器勻速將17.5 g/L的枸櫞酸噴入容器內，噴霧時間為40 s，以豚鼠出現第一聲響亮的咳嗽聲為準，開始記錄豚鼠咳嗽潛伏期及5 min內咳嗽次數，咳嗽次數＜10次和＞30次者不予選用。

次日將挑選篩選合格的豚鼠35只隨機分5組，每組7只，分為枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組，對照組 (生理鹽水)、念慈庵蜜煉川貝枇杷膏陽性藥物組(10 g/kg)，各組灌胃給藥，對照組給予生理鹽水，每天1次，連續7 d，于末次給藥前禁食不禁水12 h，末次給藥后1 h按預實驗方法重復引咳實驗，記錄豚鼠咳嗽潛伏期及5 min內豚鼠咳嗽次數。

2.3 對小鼠酚紅排泌［5］的影響 取昆明種小鼠50只，雌雄各半，分為枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組，對照組 (生理鹽水)、念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 (5.4 g/kg)，每組10只，各組按上述劑量灌胃給藥，每天1次，連續7 d，模型組則灌胃等體積生理鹽水0.1 mL/10 g，末次給藥前，禁食不禁水12 h，末次給藥30 min后，給小鼠腹腔注射0.5%苯酚紅溶液，劑量為每只0.5 mL，注射1 h后斷頸處死小鼠，沿甲狀軟骨剪下一段氣管，每只小鼠剪下的氣管要求等長，放入離心管中，加入3 mL生理鹽水和1 mol/L的氫氧化鈉溶液0.2 m L，離心 (轉速2 000 r/min，時間5 min)，取上清液，于紫外可見分光光度計546 nm波長處測量并記錄吸光值。

2.4 對辣椒素刺激豚鼠C-纖維釋放P物質的影響 取35只豚鼠，隨機分為正常組、模型組、枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組7只。實驗前禁食不禁水12 h，模型組按0.4mL/100 g灌胃生理鹽水，灌胃1 h后將豚鼠放入特制的4 000 mL燒杯中，用超聲波霧化器以最大量霧化30μmol/L辣椒素，噴霧2 min，制備辣椒素致豚鼠咳嗽模型，正常組灌胃生理鹽水后不進行噴霧。噴霧2 min后，立即取出豚鼠，深度麻醉豚鼠 (水合氯醛，0.1 m L/100 g，腹腔注射)，完整取下氣管心肺組織，用注射器套管注射5 mL冰冷的生理鹽水于氣管，共灌洗3次，收集支氣管肺泡灌洗液 (BALF)，3 500 r/min離心10 min，收集上清液，凍干，用1 mLPBS緩沖液重溶［6］，采用酶聯免疫吸附法測定P物質。

2.5 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件對數據處理，實驗結果以± s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05認為有統計學差異。

3 結果

3.1 對氨水引咳小鼠咳嗽的抑制作用 枇杷花醇提物對氨水引起小鼠咳嗽潛伏期及咳嗽次數的影響，結果見表1，念慈庵密煉川貝枇杷膏陽性藥物組、枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組均有延長小鼠咳嗽潛伏期和減少小鼠咳嗽次數的作用，與模型對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，實驗結果提示，枇杷花醇提物對氨水引起小鼠咳嗽有良好的抑制作用。

表1 對小鼠氨水引咳法的咳嗽次數和咳嗽潛伏期的影響( ± s，n=10)

表1 對小鼠氨水引咳法的咳嗽次數和咳嗽潛伏期的影響( ± s，n=10)

注:與對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1)咳嗽潛伏期/s 3min內咳嗽次數對照組 － 18.25 ±4．54 27.58 ±6．83念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 5.4 48.42 ±11．77＊＊ 13.00 ±4．13＊＊枇杷花醇提物高劑量組 4 48.17 ±12．22＊＊ 11.25 ±2．60＊＊枇杷花醇提物中劑量組 2 35.50 ±11．15＊＊ 13.75 ±4．83＊＊枇杷花醇提物低劑量組 1 35.17 ±10．14＊＊ 14.00 ±2．63＊＊

3.2 對枸櫞酸引咳豚鼠咳嗽的抑制作用 如表2所示，與對照組相比，念慈庵蜜煉川貝枇杷膏陽性藥物組、枇杷花醇提物高劑量組，中劑量組，低劑量組豚鼠咳嗽次數和咳嗽潛伏期均有顯著差異性 (P＜0.05)，枇杷花醇提物明顯抑制枸櫞酸引起的豚鼠咳嗽，具有顯著的止咳作用。

表2 對豚鼠枸櫞酸引咳法的咳嗽次數考察( ± s，n=7)

表2 對豚鼠枸櫞酸引咳法的咳嗽次數考察( ± s，n=7)

注:與對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1)5min內咳嗽次數/次咳嗽潛伏期/s對照組 － 25.28±6.32 19.57±3.31念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 10 15.43±4.16＊＊ 66.85±8.51＊＊枇杷花醇提物高劑量組 3 13.29±4.46＊＊ 73.00±6.43＊＊枇杷花醇提物中劑量組 1.5 17.71±3.68＊＊ 65.00±9.71＊＊枇杷花醇提物低劑量組 0.75 18.71±1.80* 55.57±4.93＊＊

3.3 對小鼠酚紅排泌的影響 見表3。與對照組相比，念慈庵蜜煉川貝枇杷膏陽性藥物組和枇杷花醇提物高劑量組、中劑量組、低劑量組小鼠氣管酚紅排泌量均顯著增加(P＜0.05)，提示枇杷花醇提物具有一定的祛痰作用。

表3 對小鼠酚紅排泌的影響( ± s，n=10)

表3 對小鼠酚紅排泌的影響( ± s，n=10)

注:與對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1) 酚紅/(μg·mL－1)對照組 －0.34±0.08念慈庵蜜煉川貝枇杷膏組 5.4 0.48±0.11＊＊枇杷花醇提物高劑量組 4 0.46±0.08＊＊枇杷花醇提物中劑量組 2 0.44±0.06*枇杷花醇提物低劑量組 1 0.41±0.05*

3.4 對辣椒素刺激豚鼠C-纖維釋放P物質的影響 咳嗽的產生與C-纖維受體接受刺激有關，C-纖維受體主要對化學刺激敏感，如辣椒素、枸櫞酸等。用小劑量的辣椒素可以使豚鼠氣管內C-纖維P物質釋放。表4結果顯示，模型組P物質量與正常組相比，具有顯著性差異 (P＜0.01)，證明實驗造模成功，辣椒素能顯著增加氣管P物質釋放;枇杷花醇提物高劑量組和中劑量組與模型組相比能顯著減少P物質生成 (P＜0.01)，提示，枇杷花醇提物對辣椒素致咳豚鼠氣管內C-纖維P物質釋放有一定抑制作用。

表4 對豚鼠肺氣管灌洗液P物質量影響( ± s，n=7)

表4 對豚鼠肺氣管灌洗液P物質量影響( ± s，n=7)

注:與正常組比較，*P＜0.05;與模型組比較，##P＜0.01。

組 別 劑量/(g·kg－1) P 物質/(ng·L－1)正常組 －84.59 ±7．67模型組 － 106.88±13．43##枇杷花醇提物高劑量組 3 91.61±11．99*枇杷花醇提物中劑量組 1.5 94.87±10．44*枇杷花醇提物低劑量組0.75 102.30 ±10．11

4 討論

在研究藥物鎮咳作用時，多采用機械、化學和電刺激等方法刺激動物的神經和感受器，引發咳嗽。本實驗采用化學刺激法，用氨水和枸櫞酸霧化吸入，刺激副交感神經系統，引發咳嗽，結果證明枇杷花醇提物有明顯的鎮咳作用，各劑量組對小鼠氨水和豚鼠枸櫞酸引發的咳嗽均具有明顯的拮抗作用，枇杷花醇提物能有效抑制小鼠和豚鼠的咳嗽次數和延長咳嗽潛伏期，表明其有良好的止咳作用。P物質是引起咳嗽不良反應發生的重要物質［6-7］，研究發現血管緊張素Ⅰ轉化酶(ACE)參與P物質等炎癥介質的分解，當抑制血管緊張素Ⅰ轉化酶時，氣道中炎癥介質積聚，引發咳嗽［8-10］。本實驗采用辣椒素刺激氣道模型，觀察枇杷花醇提物對C-纖維釋放P物質的影響，探討枇杷花醇提物的止咳機制，實驗結果表明，枇杷花醇提物對C纖維-P物質釋放有一定的抑制作用，抑制P物質的釋放可能為枇杷花醇提物止咳作用的機制之一。

痰液是引起咳嗽的一個重要因素，氣管、支氣管和肺泡的上皮杯狀細胞、黏膜下腺體分泌呼吸道分泌液，潤滑氣道膜、保護上皮纖毛的正常生理運動，當呼吸道受炎癥因子侵入時，纖毛運動減慢，黏膜上皮破損，黏蛋白分泌異常，最終導致黏液分泌增加，積累的黏液變成痰狀物質，刺激呼吸道黏膜引起咳嗽，因此，稀釋痰液，改善呼吸道分泌物的增加，可以發揮祛痰作用［8］。本實驗采用氣管酚紅排泌法觀察枇杷花醇提物的祛痰作用，實驗結果表明，枇杷花醇提物灌胃給藥7d后，能顯著增加小鼠氣管酚紅排泌量(P＜0.05)，具有明顯的祛痰作用，并提示，枇杷花醇提物通過增加呼吸道液的分泌能力，加快氣管纖毛運動速度，利于呼吸道分泌物咳出，達到促進痰液的排出，減輕痰液對氣管的刺激。

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