大半邊蓮中酚酸類成分與抑菌活性研究

袁勝浩， 卞金輝， 謝 珍， 黃良永， 董小萍*

(1.成都中醫藥大學藥學院，四川成都611137;2.湖北醫藥學院附屬太和醫院，湖北十堰442000)

大半邊蓮 (廣州空軍《常用中草藥手冊》)，別名肉半邊蓮《廣西實用中草藥新選》、紅半邊蓮《廣西藥用植物名錄》、紅葉子 (福建)等，系秋海棠科植物粗喙秋海棠Begonia crassirostris Irmsch的根莖或全草，主要分布于我國南部的福建、湖南、廣東、廣西以及云南等地，生于海拔300 m左右的林下濕處和巖石上。具有涼血解毒、消腫止痛之功效［1］。為了探明大半邊蓮消腫止痛的物質基礎，明確藥效物質，以更好地發揮其防病治病的功效，本實驗對大半邊蓮的次生代謝產物進行系統研究，并初步測定了單體化合物的抑菌活性。

1 儀器及材料

1.1 實驗設備 VARIN XL—200核磁共振光譜儀 (TMS內標)，ZAB—3F型EI質譜儀 (THERMO QUEST公司)，AZB—HS型FAB質譜儀 (VG公司)，旋轉蒸發儀RE—52A(上海亞榮生化儀器廠)，折光儀 (WZS—I842266上海阿貝)，硅膠G薄層層析板 (青島海洋化工廠)，柱色譜硅膠G(200～300目，青島高能達化工有限公司)，96微孔板，酶標儀，超凈工作臺，高壓滅菌鍋，恒溫培養箱。

1.2 植物材料 大半邊蓮樣品2010年8月采自廣西桂林，

由桂林醫學院藥學院王曉華博士鑒定為秋海棠科植物粗喙秋海棠B．crassirostris Irmsch的塊根。

1.3 實驗菌株 金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、大腸桿菌 (湖北醫藥學院基礎醫學院提供)。

2 方法

2.1 大半邊蓮的提取與分離 大半邊蓮粗粉15 kg，用甲醇滲漉提取，回收甲醇，得到甲醇提取物795 g。將所得的甲醇提取物加水懸浮，再加入等量乙酸乙酯萃取，靜置分層，在水和乙酸乙酯中間有一乳化層，收集乳化層，濃縮得到浸膏381 g。浸膏經硅膠柱層析CHCl3-MeOH(7∶3)洗脫粗分得到 A、B、C、D、E、F共6段。Fr．C經MCI和Rp-8柱色譜交替柱層析，均以甲醇-水 (2∶8～9∶1)梯度洗脫，分離得到化合物1(89 mg)和2(42 mg)。Fr．D經硅膠柱層析CHCl3-MeOH(75∶25)洗脫分為D1和D2兩部分，Fr．D1經Rp-8柱色譜，甲醇-水(2∶8～9∶1)梯度洗脫，分離得到化合物3(20 mg);Fr．D2在甲醇中結晶，得到化合物6(10 mg)。Fr．E經Rp-8柱色譜，甲醇-水(3∶7～9∶1)梯度洗脫，分離得到化合物4(15 mg)。Fr．F經MCI柱色譜，甲醇-水 (4∶6～9∶1)梯度洗脫，分離得到化合物5(38 mg)。

2.2 化合物最小抑菌濃度 (MIC值)的測定［2］采用液體培養基連續稀釋法培養后檢測每個化合物對供試菌株的最小抑菌濃度 (MIC)。方法為:①配制質量濃度為2.00 mg/mL的藥液10 mL，用肉湯液體培養基將各試驗藥按倍半稀釋法稀釋為1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32和1∶64，共7個濃度。②實驗操作在96微孔板上進行，每試驗微孔用移液槍加入液體培養基100μL，試驗菌液加20 μL，藥液120μL，混勻后置37℃培養，培養24 h后觀察。每個實驗3個重復，并設立不加實驗菌的本底對照 (120 μL藥液+120μL液體培養基)和陽性對照 (鹽酸小檗堿)。③采用酶標儀檢測微孔板實驗菌的生長情況，檢測指標為微孔中培養液體系的光密度 (OD值)，檢測波長620 nm。實驗微孔的OD值減去同濃度的本底對照的OD值即為實驗微孔的OD凈值。根據OD凈值判定藥物對該實驗菌的MIC值。

3 結果與分析

3.1 結構鑒定

化合物1:C7H6O3，白色無定形粉末，mp 158～159℃，易溶于甲醇。EI-MS m/z(%):139［M+H］+，121(100)。13C-NMR［600MHz，CD3OD］δ:115.5(C-1)，158.7(C-2)，119.5(C-3)，136.3(C-4)，119.9(C-5)，130.5(C-6)，172.6(－COOH);1H-NMR ［600MHz，CD3OD］δ:6.95(1H，d，J=8.8 Hz，H-3)，7.24(2H，t，J=8.1，7.6 Hz，H-4，5)，7.30(1H，d，J=7.2 Hz，H-6)。其波譜數據與文獻［3-4］報道水楊酸一致，故鑒定化合物1為水楊酸 (salicylic acid)。

化合物2:C7H6O3，白色無定形粉末，mp 202～204℃，易溶于甲醇。ESI-MS m/z(%):139［M+H］+。13CNMR［600MHz，CD3OD］δ:133.3(C-1)，117.2(C-2)，158.7(C-3)，120.9(C-4)，130.4(C-5)，121.0(C-6)，170.0(－ COOH);1H-NMR ［600MHz，CD3OD］δ:7.42(1H，t，H-2)，7.48(1H，d，J=7.7 Hz，H-4)，7.25(1H，t，J=7.8 Hz，H-5)，6.99(1H，d，J=7.4 Hz，H-6)。其波譜數據與文獻 ［5-6］報道間羥基苯甲酸一致，故鑒定化合物2為間羥基苯甲酸 (M-hydroxybenzoic acid)。

化合物3:C10H10O4，白色無定形粉末，mp 172～174℃，易溶于甲醇。EI-MS m/z(%):195［M+H］+，121(100)。1H-NMR［600MHz，CD3OD］δ:7.19(1H，brs，H-2)，6.85(1H，brd，J=8.1 Hz，H-5)，7.10(1H，d，J=8.1 Hz，H-6)，7.65(1H，d，J=15.2 Hz，H-7)，6.39(1H，d，J=15.2 Hz，H-8)，3.90(3H，s， － OCH3);13C-NMR［600MHz， CD3OD］δ:127.6(C-1)，112.8(C-2)，149.6(C-3)，148.4(C-4)，115.9(C-5)，116.3(C-6)，146.5(C-7)，123.5(C-8)，168.5(C-9)，57.0(－OCH3)。其波譜數據與文獻［7-8］報道阿魏酸一致，故鑒定化合物3為阿魏酸 (ferulic acid)。

化合物4:C16H18O9，白色無定形粉末，mp 206～208℃，易溶于甲醇。ESI-MS m/z:353［M-H］－。1H-NMR［600MHz，CD3OD］δ:1.98(2H，m，H-2)，4.12(1H，m，H-5)，3.68(1H，m，H-4)，5.29(1H，m，H-3)，2.03(4H，m，H-6)，6.98(1H，d，J=1．9 Hz，H-2')，6．75(1H，d，J=8.0 Hz，H-5')，6．92(1H，dd，J=8.0，1.9 Hz，H-6')，7．50(1H，d，J=16.2 Hz，H-7')，6．19(1H，d，J=16.2 Hz，H-8')。13C-NMR［600MHz，CD3OD］δ:75.2(C-1)，38.5(C-2)，72.0(C-3)，70.9(C-4)，68.5(C-5)，38.0(C-6)，177.0(C-7)，125.5(C-1')，116.1(C-2')，147.2(C-3')，148.3(C-4')，115.4(C-5')，122.7(C-6')，145.2(C-7')，116.0(C-8')，165.9(C-9')。其波譜數據與文獻［7-9］報道綠原酸一致，故鑒定化合物4為綠原酸 (chlorogenic acid)。

化合物5:C7H6O5，白色晶體，mp 235～238℃，易溶于甲醇。ESI-MS m/z(%):171［M+H］+。1H-NMR［600MHz，CD3OD］δ:7.02(2H，s，H-2，6)。13C-NMR［600MHz，CD3OD］δ:121.5(C-1)，110.8(C-2，6)，146.2(C-3，5)，139.5(C-4)，168.5(－COOH)。其波譜數據與文獻［10-11］報道沒食子酸一致，故鑒定化合物5為沒食子酸 (gallic acid)。

化合物6:C7H6O4，白色晶體，mp 198～200℃，易溶于 甲 醇。ESI-MS m/z(%):155 ［M+H］+。1H-NMR［600MHz，CD3OD］δ:7.53(1H，s，H-2)，6.80(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，7.46(1H，d，J=8.5，2.0 Hz，H-6)。13C-NMR［600MHz，CD3OD］δ:123.2(C-1)，117.5(C-2)，146.1(C-3)，151.5(C-4)，116.0(C-5)，124.2(C-6)， 169.8(－COOH)。其波譜數據與文獻 ［5，12］報道原兒茶酸一致，故鑒定化合物6為原兒茶酸 (Protocatechuic acid)。

3.2 抑菌活性 結果見表1。

表1 化合物1～6對5種菌株的最低抑菌質量濃度

從大半邊蓮中分離得到的6個酚酸類單體化合物對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和大腸桿菌等5種常見敏感菌的抑菌活性 (陽性對照為鹽酸小檗堿)測定結果見表1，6個酚酸類單體對5種敏感菌均有一定的抑制作用，但是抗菌譜和抗菌能力有較大的差異。在抗菌譜方面，水楊酸和原兒茶酸的抑菌譜最廣，阿魏酸次之，間羥基苯甲酸最小;而在抗菌活性方面，原兒茶酸的抑菌活性最強，間羥基苯甲酸最弱。

4 討論

本課題首次對大半邊蓮進行化學成分研究，分離得到了6個酚酸類化合物，體外抗菌實驗表明它們均有一定的體外抑菌活性。大半邊蓮的化學研究是其資源規模化開發利用和藥理藥效等各項研究工作的前提和基礎，對化學成分的系統研究將有助于我們探明其藥效物質基礎，促進指紋圖譜的建立和質量標準的制定，為進一步開發利用大半邊蓮藥用植物資源提供科學依據。

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