醇提蛋黃油對小鼠燙傷愈合作用的機理研究

謝欣梅， 龐曉斌， 叢 悅

(河南大學藥物研究所，河南開封475004)

燒燙傷是生活中常見的意外傷害，沸水、滾粥、熱油、熱蒸氣的燒燙是常會發(fā)生的事。對某些燒燙傷，如果處理不及時，就可能導致并發(fā)癥，如長期殘疾，住院時間延長，身體四肢的損失甚至死亡。目前臨床燒燙傷創(chuàng)面用藥已有多種，以應用京萬紅、濕潤燒傷膏多見，但目前臨床已用的創(chuàng)面用藥不同程度地存在著創(chuàng)面感染控制不理想、疼痛加重、瘢痕增生等副作用。

蛋黃油 (又稱蛋黃脂質(zhì))是雉科動物家雞的鮮卵經(jīng)分離提取而得到的提取物，含卵磷脂、脂肪酸、鐵、鋅等多種藥用和營養(yǎng)成分。蛋黃油是傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒消腫、滋陰養(yǎng)血潤燥、斂瘡生肌長肉之功效。外用蛋黃油治病的方法在北周《集驗方》、《日華子本草》、《本草綱目》、《醫(yī)林纂要》、《本草品匯精要》等歷代專著中均有記載［1］。

蛋黃油制備方法有多種，傳統(tǒng)方法包括干餾法、烘烤法，近年來人們致力于溶劑提取、酶提取、超臨界CO2萃取等研究。關(guān)于蛋黃油的有關(guān)研究多見于臨床療效，且所用制品均為干餾法制品，療效確切、顯著［2］，但其他方法制品療效鮮有報道。由于蛋黃油的成分較多，不同的提取方法對成分的量變化又有一定的影響，所以關(guān)于蛋黃油的藥理學研究難度相對較大。

本實驗以乙醇滲漉法提取蛋黃油，在小鼠深Ⅱ度燙傷的創(chuàng)面上應用藥物，通過對創(chuàng)面愈合率、愈合天數(shù)和創(chuàng)面皮膚的羥脯氨酸量、超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽過氧化物酶活性的檢測，研究醇提蛋黃油對燒燙傷創(chuàng)面愈合的治療作用，為蛋黃油制品的合理開發(fā)和臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 健康昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g。由河南省實驗動物中心提供，合格證號0093638。實驗動物飼養(yǎng)在清潔級動物房。

1.2 藥物與試劑 醇提蛋黃油:本校藥物研究所提取所得。美寶濕潤燒傷膏:汕頭市美寶制藥有限公司產(chǎn)品，批準文號:國藥準字Z20000004。SOD、GSH-Px、HOP試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。其他試劑均為國產(chǎn)分析級。

1.3 儀器 751紫外分光光度計 (日本島津)，酶標儀(北京普朗);高速離心機 (臺式高速冷凍離心機:美國雅培)，電熱恒溫培養(yǎng)箱 (上海益恒實驗儀器有限公司DHP-9272型)，F(xiàn)SH-2型可調(diào)高速組織勻漿機 (江蘇省金壇市恒豐儀器廠)，多功能滲漉提取器 (EX-TE-03上海順義實驗設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 醇提蛋黃油制備 滲漉法［2-4］:取雞蛋煮熟去殼，剝?nèi)〉包S，搗碎，先用少量乙醇濕潤后裝入滲漉提取器，再加乙醇使其液面高出蛋黃粉2～3 cm靜置36 h，加8倍于蛋黃質(zhì)量的乙醇進行滲漉，得醇油混合滲漉液，90℃回收乙醇即得蛋黃油。經(jīng)消毒滅菌后裝瓶備用，常溫下保存。此油為橘黃色透明油狀物，味芳香。

2.2 燙傷模型制備及動物分組

燙傷模型制備［5-6］:動物于試驗前24 h用硫化鈉脫毛劑脫毛后，生理鹽水洗凈，用直徑1.2 cm、高4 cm的塑料無底圓筒于脫毛處90℃水停留5 s，造成Ⅱ度燙傷，病理切片證實。

實驗動物分組:將小鼠隨機分為模型組、濕潤燒傷膏陽性對照組、醇提蛋黃油實驗組，每組30只小鼠。

于燙傷0.5 h后各組分別在燙傷部位涂抹給藥2 mL(2 g)/只，每天給藥2次，連續(xù)21 d。模型組給予生理鹽水處理。

2.3 創(chuàng)面愈合時間、愈合率測定

創(chuàng)面愈合時間:以結(jié)痂全部脫落、創(chuàng)面完全上皮化為愈合標準，觀察創(chuàng)面結(jié)痂、愈合時間及愈合動物數(shù)，進行統(tǒng)計學檢驗。

創(chuàng)面愈合率［6］:傷后7、14、21 d測創(chuàng)面愈合率。先將創(chuàng)面描記在半透明紙上，再以此為模板，將質(zhì)地均勻的硬紙片剪成同樣大小，然后用天平稱定質(zhì)量，以硬紙片質(zhì)量間接表示創(chuàng)面面積大小。按下式計算創(chuàng)面愈合率:創(chuàng)面愈合率 (%)=(原始創(chuàng)面面積－未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

2.4 創(chuàng)面組織勻漿制備及生化指標檢測 傷后3、5、7、14 d各組隨機處死3只小鼠，切取創(chuàng)面組織標本 (創(chuàng)面已愈合則取瘢痕組織)，稱定質(zhì)量，加入適量生理鹽水，冰浴條件下制成10%組織勻漿，離心15 min(3 000 r/min，4℃)后取上清液。羥脯氨酸水平測定采用比色法，超氧化物歧化酶活性測定采用黃嘌呤法，GSH-Px采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法。具體測定方法參照試劑盒說明書進行。

2.5 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 10.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用± s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為有顯著性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 對燙傷小鼠皮膚愈合率的影響 燙傷后多數(shù)小鼠出現(xiàn)渾身顫抖現(xiàn)象，涂抹蛋黃油后短時間內(nèi)顫抖現(xiàn)象減弱直至停止，表明蛋黃油有明顯的止痛作用。

與模型組相比，醇提蛋黃油組和濕潤燒傷膏組均可顯著縮短結(jié)痂時間和創(chuàng)面愈合時間 (P＜0.01，P＜0.01);蛋黃油實驗組小鼠瘡面結(jié)痂早于濕潤燒傷膏組 (P＜0.05)，而且創(chuàng)面更干凈;蛋黃油實驗組和濕潤燒傷膏組的創(chuàng)面愈合時間之間差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。小鼠在給藥7、14、21 d后各組小鼠創(chuàng)面愈合率隨時間延長而上升，在各時間段蛋黃油實驗組和濕潤燒傷膏組小鼠創(chuàng)面愈合率高于模型組，差異顯著 (P＜0.01);蛋黃油實驗組和濕潤燒傷膏對照組間也存在顯著差異 (P＜0.05)見表1，圖1。

表1 蛋黃油對小鼠皮膚愈合的影響( ± s，n=18)

表1 蛋黃油對小鼠皮膚愈合的影響( ± s，n=18)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與濕潤燒傷膏組比較，#P＜0.05。

組 別 結(jié)痂時間/d 愈合時間/d 愈合率/%7 d 14 d 21 d醇提蛋黃油組 3.7±0.63*# 13.3±1.21*# 51.34±2.55*#94.71±4.45 98.89±1.12濕潤燒傷膏組 5.7±1.42* 15.4±1.32* 48.31±1.32* 88.96±5.78 96.45±2.87模型組 7.7±0.62 18.9±0.94 30.13±2.07 53.36±4.65 78.44±3.21

圖1 7 d及14 d小鼠燙傷創(chuàng)面圖

3.2 創(chuàng)面肉芽組織中羥脯氨酸水平 各組創(chuàng)面羥脯氨酸水 平在燙傷后呈先升后降的趨勢。傷后第3天，醇提蛋黃油組羥脯氨酸水平明顯高于模型組 (P＜0.01)，與濕潤燒傷膏組有顯著差異 (P＜0.05)。傷后第5天醇提蛋黃油組達高峰值，顯著高于模型組 (P＜0.01))和濕潤燒傷膏組(P＜0.05)。濕潤燒傷膏組第7天達高峰值，模型組到14 d達測量期間高峰。見表2。

表2 創(chuàng)面肉芽組織中羥脯氨酸水平( ± s，n=3)

表2 創(chuàng)面肉芽組織中羥脯氨酸水平( ± s，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與濕潤燒傷膏組比較，#P ＜0.05。

組 別 羥脯氨酸/(μg·mg－1)3 d 5 d 7 d 14 d醇提蛋黃油組 17.34±2.46*# 25.67±1.97*#23.16±2.14*21.86±2.18濕潤燒傷膏組 14.17±1.52* 20.74±2.63* 23.91±1.95*21.64±3.15模型組 10.11±2.01 15.55±2.09 18.14±1.87 20.78±2.04

3.3 創(chuàng)面肉芽組織中SOD及GSH-Px活性 傷后各組SOD及GSH-Px活性均表現(xiàn)出隨時間延長而上升的趨勢。造模后3 d醇提蛋黃油組SOD、GSH-Px活性較低，但明顯高于模型組 (P＜0.01)。說明傷后創(chuàng)面內(nèi)源性的抗脂質(zhì)過氧化能力顯著降低，而醇提蛋黃油具有上調(diào)創(chuàng)面組織抗氧化的能力。傷后5、7、14 d各組 SOD活力、GSH-Px活性隨時間延長而上升，醇提蛋黃油組上升速度顯著高于模型組 (P＜0.01)，傷后5、7 d SOD活力、GSH-Px活性與濕潤燒傷膏組統(tǒng)計學差異顯著 (P＜0.05)。見表3、表4。

表3 創(chuàng)面肉芽組織中SOD活性( ± s，n=3)

表3 創(chuàng)面肉芽組織中SOD活性( ± s，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與濕潤燒傷膏組比較，#P ＜0.05。

組 別SOD活性/(U·mg－1Pro)3 d 5 d 7 d 14 d醇提蛋黃油組 13.68±2.65* 22.42±1.97*#26.71±1.18*#29.61±1.91*濕潤燒傷膏組 12.81±1.16* 17.95±1.78* 23.16±2.43* 28.36±1.87*模型組6.64±1.92 13.61±3.45 18.32±3.27 23.74±2.98

表4 創(chuàng)面肉芽組織中GSH-Px活性( ± s，n=3)

表4 創(chuàng)面肉芽組織中GSH-Px活性( ± s，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與濕潤燒傷膏組比較，#P ＜0.05。

組 別 SOD活性/(U·mg－1Pro)3 d 5 d 7 d 14 d醇提蛋黃油組 2.13±0.42* 2.84±0.71*# 3.12±0.67*#3.46±0.53*#濕潤燒傷膏組 1.91±0.41* 2.36±0.52* 2.53±0.93* 2.77±0.68*模型組1.17±0.52 1.75±0.43 2.16±0.47 2.31±0.72

4 討論

蛋黃油為民間廣為流傳的傳統(tǒng)中藥，其制備方法有多種，傳統(tǒng)的干餾法出油率低，環(huán)境污染嚴重，產(chǎn)品質(zhì)量不易控制，難以大規(guī)模生產(chǎn);近年來人們也比較了不同的提取方法對其成分量變化的影響［7-10］，但關(guān)于藥效學方面的研究未見報道。本研究通過實驗動物愈合率、生化指標等檢測指標來評價醇提蛋黃油對燙傷創(chuàng)面的影響作用。

燒燙傷后創(chuàng)面愈合時間和創(chuàng)面愈合面積百分比是評價創(chuàng)面愈合的一個綜合性指標［11-12］。本次實驗結(jié)果表明，醇提蛋黃油可明顯促進燙傷創(chuàng)面愈合，在縮短結(jié)痂時間和縮小疤痕面積方面更優(yōu)于濕潤燒傷膏，表明醇提蛋黃油有良好的促進皮膚傷口愈合作用，并能顯示一定的時效關(guān)系。

燙傷后多數(shù)小鼠出現(xiàn)渾身顫抖現(xiàn)象，涂抹蛋黃油后短時間內(nèi)顫抖現(xiàn)象減弱直至停止，表明蛋黃油有明顯的止痛作用［13］。

在深度燒傷創(chuàng)面修復過程中，膠原的沉積和修復是深度創(chuàng)面愈合的突出表現(xiàn)［14-15］。羥脯氨酸在膠原中所占比例恒定，是創(chuàng)面愈合評價指標之一。本次實驗結(jié)果顯示:本組動物造模后第5天醇提蛋黃油實驗組的羥脯氨酸量即達最高峰，明顯高于模型組 (P＜0.01);而濕潤燒傷膏組在造模后第7天的羥脯氨酸量達最高峰，提示醇提蛋黃油可有效促進創(chuàng)面修復后期的膠原沉積，增加皮膚膠原纖維和膠原蛋白的水平，有利于創(chuàng)面的修復，并且效果較濕潤燒傷膏更有優(yōu)勢。

深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的表皮和真皮產(chǎn)生大量自由基，可引起明顯的脂質(zhì)過氧化反應，導致血管通透性增加，造成燒燙傷水腫形成［16-17］。燒燙傷后皮膚的屏障功能被破壞，微生物可經(jīng)燒燙傷創(chuàng)面侵入，引起局部或全身感染，加劇氧自由基對細胞的損傷。SOD、GSH-Px是體內(nèi)常見的自由基清除劑，具有抗脂質(zhì)過氧化反應的作用［17］。本次實驗結(jié)果顯示，各組在燙傷后的第3天，創(chuàng)面SOD、GSH-Px活性均為測定點內(nèi)最低值，以后隨時間的延長上升，而醇提蛋黃油實驗組在各時間點的SOD、GSH-Px活性明顯高于模型組(P＜0.01)，說明造模后創(chuàng)面內(nèi)源性的抗脂質(zhì)過氧化能力顯著降低，而蛋黃油可以上調(diào)燙傷組織內(nèi)氧化防御系統(tǒng)的活性，保護機體免受氧化應激損傷，減輕由此導致的血管通透性增加以及由此引發(fā)的感染問題。

綜上所述，本研究結(jié)果提示醇提蛋黃油具有良好的促進燙傷創(chuàng)面愈合的作用。本實驗為打破長期以來干餾蛋黃油在臨床應用中這種單一制品形式奠定了一定理論基礎(chǔ)。蛋黃油是個具有廣闊應用價值的燒燙傷創(chuàng)面外用藥，其制劑的提取工藝與廣泛應用值得深入研究。

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