門冬氨酸鳥氨酸注射液細菌內毒素檢查法的研究

許雷鳴 武 谷 顧 倩

1.安徽省食品藥品檢驗所，安徽合肥 230051；2.皖南醫學院，安徽蕪湖 241000

門冬氨酸鳥氨酸注射液為肝膽疾病輔助用藥，臨床上主要用于因急、慢性肝病（如各型肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝炎后綜合征）引發的血氨升高及治療肝性腦病，尤其適用于治療肝昏迷早期或肝昏迷期的意識模糊狀態。國內市場上已有本品的進口藥品，目前尚無國內藥廠的門冬氨酸鳥氨酸注射液上市。門冬氨酸鳥氨酸注射液的國家食品藥品監督管理局進口藥品注冊標準采用家兔法進行熱原檢查，本實驗根據 《中國藥典》2010年版二部 “細菌內毒素檢查法”[1]99-101和“化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則”[1]212-213，以及相關細菌內毒素檢查的文獻[2-12]，對門冬氨酸鳥氨酸注射液應用鱟試劑進行細菌內毒素檢查的可行性進行了研究并建立了門冬氨酸鳥氨酸注射液的細菌內毒素檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

VS-1300L-U 潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），S648 恒溫水浴鍋（上海醫療器械七廠），XW-80A 混旋儀（上海滬西分析儀器廠有限公司），微量取液器（50～250 μL，上海榮泰生化工程有限公司），細菌內毒素檢查用具（湛江博康海洋生物有限公司），智能熱原儀（天津大學無線電廠精密儀器廠，ZRY-2D型）。

1.2 細菌內毒素檢查用水

細菌內毒素檢查用水（福州新北生化工業有限公司，批號：11102021，規格：100 mL/瓶）。

1.3 細菌內毒素工作標準品（凍干品）

細菌內毒素工作標準品（凍干品）（中國食品藥品檢定研究院，效價：120 EU/支，批號：150601-201072）。

1.4 鱟試劑與家兔

鱟試劑（福州新北生化工業有限公司，批號：11091912，靈敏度：0.25 EU/mL，規格：0.1 mL/支；湛江博康海洋生物有限公司，批號：1112010，靈敏度：0.25 EU/mL，規格：0.1 mL/支）；新西蘭兔，普通級，體重1.7 kg 以上，購自南京青龍山動物繁殖場，生產許可證號為SCXK（蘇）2007-0008。

1.5 藥品

門冬氨酸鳥氨酸注射液（規格：10 mL∶5 g，批號：110901，110902，110903， 由合肥一公司生產； 規格：10 mL∶5 g，批號：010571，010581，010591，由德國麥氏大藥廠生產）。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

按《中國藥典》2010年版二部附錄細菌內毒素檢查法[1]對兩個廠家的鱟試劑進行靈敏度復核試驗，結果見表1。由結果可知，2λ管均為陽性，0.25λ管和陰性對照管均為陰性，兩個不同廠家的2 批鱟試劑靈敏度測定值均在0.5λ～2.0λ范圍內，符合要求，可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果

2.2 內毒素限值（L）的確定[1-4]

參照藥品說明書，門冬氨酸鳥氨酸注射液臨床用法用量如下：在使用前應該用注射用溶液稀釋，然后經靜脈輸入。由于靜脈耐受方面的原因，每500 毫升溶液中不要溶解超過6 安瓿該藥物，輸入速度最大不要超過每小時1 安瓿該藥物。根據公式 L=K/M，注射劑 K=5 EU/（kg·h），式中M 為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，人均體重按60 kg 計算，則 L=30 EU/mL，根據《中國藥典》2010年版二部“化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則”[2]，由于藥物和適應證（如抗感染、抗腫瘤、心血管藥等急重病癥用藥、兒童老人用藥、復合用藥、大輸液等）的不同，限值可適當嚴格，至計算值的1/3～1/2，以保證安全用藥，所以最終確定限值（L）為 1/3×30 EU/mL=10 EU/mL。

2.3 干擾試驗預試驗

根據公式MVD=C×L/λ，目前市售鱟試劑λ通常在0.50～0.03 EU/mL，則門冬氨酸鳥氨酸注射液對應的最大有效稀釋倍數分別為 20、40、80、160、320 倍。取樣品一批（批號：110901），將門冬氨酸鳥氨酸注射液用細菌內毒素檢查用水分別配制成為原液、10、20、40、80倍稀釋液，將此系列溶液記為NPC。同法制備上述系列溶液，在其中加入細菌內毒素標準溶液，使每一濃度的溶液中均含有2λ（0.50 EU/mL）濃度的細菌內毒素，記此系列溶液為PPC。取2個廠家的鱟試劑分別與上述NPC 和PPC 進行反應，混勻后封口，置37℃恒溫水浴60 min。每一濃度重復2 管，并設陰性對照（NC）和陽性對照（PC）。干擾試驗預試結果見表2。預試結果表明，樣品在20倍以下稀釋倍數時可能對反應有抑制性干擾作用；樣品的20倍以上稀釋倍數可能對反應無干擾作用。

表2 門冬氨酸鳥氨酸注射液干擾試驗預試結果

2.4 干擾試驗

為了最終確認是否存在干擾因素的影響，取門冬氨酸鳥氨酸注射液用細菌內毒素檢查用水分別進行稀釋，使其正式干擾試驗稀釋倍數為20倍，按《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細菌內毒素檢查法”凝膠法干擾試驗項進行試驗，結果見表3。正式干擾試驗結果表明，采用福州新北生化工業有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生產的靈敏度均為0.25 EU/mL的鱟試劑進行試驗，Es均在0.5λ～2.0λ 內且Et/Es均在0.5～2.0 之間，確認樣品稀釋20倍后對細菌內毒素檢查無干擾。

表3 門冬氨酸鳥氨酸注射液干擾試驗結果

2.5 質量標準起草

取本品，依法檢查（《中國藥典》2010年版二部附錄XIE），每1 毫升中含內毒素的量應小于10 EU。

2.6 樣品細菌內毒素檢查與家兔熱原檢查的對比試驗

根據“2.4”項下結果，取兩個廠家6 批樣品用細菌內毒素檢查用水稀釋20倍后，分別用兩個不同廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑按本研究起草的標準和 《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪE“細菌內毒素檢查法”凝膠限度試驗對樣品進行細菌內毒素檢查，結果6 批樣品的細菌內毒素檢查結果均符合起草的質量標準要求。另取此6 批樣品，按照門冬氨酸鳥氨酸注射液的進口藥品注冊標準JX20020348，每1 千克家兔體重注射1.0 mL，分別按《中國藥典》2010年版二部附錄ⅪD“熱原檢查法”進行熱原檢查，結果6 批樣品均符合規定。對比試驗表明門冬氨酸鳥氨酸注射液的細菌內毒素檢查法與家兔熱原檢查法的檢查結果一致。

3 討論

目前，常見的熱原檢查方法為家兔法和鱟試劑法。與傳統的家兔熱原檢查法相比，細菌內毒素檢查法具有操作簡便，檢驗周期短，結果準確，檢測靈敏度高，符合對實驗動物減少、替代、優化的3R 原則等優點。鱟試劑法關鍵內容是確定藥品的細菌內毒素檢查限值，建立細菌內毒素檢查方法。不同廠家的鱟試劑在工藝、質量等方面有一定差異，其抗干擾能力也存在差異，通過采用2個不同廠家的鱟試劑對2個廠家共6個批號的門冬氨酸鳥氨酸注射液樣品進行試驗，可客觀地評價樣品濃度對鱟試劑與內毒素發生凝集反應的干擾程度，確定對細菌內毒素檢查無干擾的樣品濃度范圍。結果表明：本品稀釋20倍以后對內毒素檢查無干擾，可進行細菌內毒素檢查。根據試驗結果和臨床實際應用情況，可以確定門冬氨酸鳥氨酸注射液細菌內毒素檢查方法如下：取本品，依法檢查（《中國藥典》2010年版二部附錄XIE），每1 毫升中含內毒素的量應小于10 EU。此可為門冬氨酸鳥氨酸注射液的細菌內毒素檢查質量標準，細菌內毒素檢查法可代替家兔熱原檢查法用于門冬氨酸鳥氨酸注射液的質量控制。

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