棗結果枝核糖體蛋白的生物信息學分析

戎宏立 ，王長彪 ，李 倩 ，孟玉平 ，曹秋芬 ，3

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031；3.農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室，山西太原030031）

核糖體蛋白質（RP）是一種廣泛存在的RNA結合蛋白，它與核糖體RNA共同組成了核糖體。目前，已發現的核糖體蛋白有80多種。以往認為，RP的功能僅僅是與核糖體RNA（rRNA）共同參與蛋白質的合成，但近年來隨著技術手段的進步和科學研究的深入，發現RP有諸多復雜的核糖體外功能，對于RP功能的探索成為科學領域的一大熱點。

目前，研究發現的RP的核糖體外功能主要包括：調控轉錄和翻譯，調控細胞增殖、凋亡、分化，參與胚胎發育，參與癌癥發生等[1-5]。曹秋芬等[6-10]已經成功構建了棗結果枝的cDNA文庫，并對水通道蛋白、金屬硫蛋白、抗壞血酸過氧化物酶等一些有研究價值的基因，進行了表達載體的構建、體外脅迫表達等一系列的研究分析。但是關于棗樹核糖體蛋白基因的分析目前尚處于空白階段。

本研究利用生物信息學手段對棗樹的核糖體蛋白基因進行相關分析，對進一步認識棗樹的生物合成過程，查找其與其他物種的差異性，進而發掘棗樹的優良基因具有十分重要的理論指導意義。

1 材料和方法

1.1 材料

棗樹結果枝ESTs序列來源于山西省農科院生物技術研究中心曹秋芬課題組構建的壺瓶棗（Ziziphusjujuba Millhupingzao）結果枝cDNA文庫。

1.2 方法

1.2.1 ESTs功能注釋 利用Blast2GO軟件對測序后的EST進行功能注釋[11-12]。分析所用參數為:

BLAST：

Blast DB:nr；Number of Blast Hits:20；Blast Expect value:1e-25；Blast Program:blastx；Blast Mode:QBlast-NCBI；HSPLength cutoff:33.

Annotation configuration：

Pre-eValue-Hit-Filter:1e-25；Pre-Smiliarity-Hit-Filter:15；Annotation CutOff:55；GOWeight:5.

1.2.2 核糖體蛋白基因的分析[13-18]從經過功能注釋的ESTs序列中篩選出核糖體蛋白基因，用Clustal x1.83進行比對去除冗余序列，通過Blastx搜索NCBI的核苷酸數據庫，序列相似性分析獲得具有完整ORF的棗核糖體蛋白基因；利用DNAStar軟件中的EditSeq程序分析棗樹核糖體蛋白基因的核苷酸、氨基酸序列的組成及理化性質、查找開放閱讀框（ Open Reading Frame，ORF）并進行翻譯；利用SOPMA在線工具完成蛋白質二級結構的預測；利用在線軟件ProtScale Server和NetPhos 2.0 Server分別對棗核糖體蛋白基因的氨基酸序列疏水性/親水性及潛在磷酸化位點進行預測分析；利用PSORT對棗樹核糖體蛋白質進行亞細胞定位；利用DNAStar軟件中的MegAlign程序通過氨基酸比對構建系統進化樹，參數為默認。

2 結果與分析

2.1 ESTs功能注釋

通過篩選棗生長初期結果枝的cDNA文庫，選取長度500 bp以上的625個ESTs序列進行測序，得到522個有用序列，其中，397個ESTs序列與NCBI中已知功能基因相似性較高，占76.1%；有125個ESTs是NCBI中沒有的未知序列，占23.9%。對397個已知功能的ESTs序列進行分類整理，發現有42個基因含有2個以上的ESTs，重復表達的ESTs共77個，表達量最多的是40S核糖體蛋白，S27有6個ESTs，其次富含脯氨酸蛋白有5個ESTs，類萌蛋白有4個ESTs。本研究還發現，522個ESTs中，與抗氧化相關的基因有：超氧化物歧化酶、2-cys過氧化還原酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶；與抗逆相關的基因有：玉米黃質環氧化酶、shaggy蛋白激酶、親環蛋白、gast蛋白、鋁誘導蛋白、富含脯氨酸蛋白、硫氧還蛋白、熱休克蛋白等（表1）。這些有用的棗結果枝抗逆相關基因需要進一步研究分析，以期為棗樹的基因研究，品種選育、改良提供有力的試驗依據。

表1 棗結果枝抗逆相關基因功能注釋

將397條有功能注釋的ESTs序列分成生物進程 （Biological Process）、 細胞組分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）3個類型。從圖1可以看出，生物進程中比例最大的是 metabolic process，其次是 cellular process；從圖2可以看出，細胞組分中占最大比例的是cell，其次為organelle；從圖3可以看出，分子功能中比例最大的是binding，其次是catalytic activity。3個類型的注釋結果統計反映出cDNA文庫中基礎代謝相關的基因、蛋白質合成表達量比較多；而本研究材料為棗生長初期的結果枝，其細胞生長旺盛，蛋白合成轉運活躍，二者反映的情況是一致的。

320條ESTs通過KEGG數據庫進行代謝分析，得到123條ESTs的62個代謝途徑，其中，淀粉和蔗糖代謝途徑（Starch and sucrosemetabolism）最多（7條，5.69%），其次是卟啉和葉綠素代謝途徑（Porph-yrin and chlorophyll metabolism；6條，4.88%）（ 表2）。

表2 棗結果枝EST代謝途徑分析

2.2 核糖體蛋白基因的分析

篩選棗結果枝ESTs，去除冗余的序列，獲得24條具有完整ORF的核糖體蛋白ESTs。利用DNAStar軟件中的EditSeq程序分析它們的核苷酸、氨基酸序列組成及理化性質，結果表明，24條核糖體蛋白基因中最長為60S核糖體蛋白L5，為912 bp；最短的為60S核糖體蛋白L29-1，為183 bp。而分子量最大的是50S核糖體蛋白L4，分子量為32 764.44，最小的是40S核糖體蛋白S30，分子量為6 931.12。核糖體蛋白多肽大多呈堿性，只有50S核糖體蛋白L12為弱酸性，其PI為5.55。用SOPMA預測棗核糖體蛋白氨基酸序列的二級結構，結果顯示，α-螺旋和無規則卷曲是棗核糖體蛋白的主要結構元件，而β-轉角和延伸鏈則散布于整個蛋白質中。

用ProtScale Server對棗核糖體蛋白基因的氨基酸序列疏水性/親水性進行預測，負值越小表示親水性越強，正值越大表示疏水性越強，介于－0.5～＋0.5之間的為兩性氨基酸。分析結果顯示，60S核糖體蛋白L29-1（圖4）多肽鏈整條都處于親水區域，其中，第36位的天冬氨酸（Asp）具有最高分值-0.611，第51位的天冬酰胺（Asn）親水性最強，具有最低分值-3.667；40S核糖體蛋白 S25（ 圖 5）、60S核糖體蛋白 L13-1（ 圖6）在N端具有一個明顯的親水區域；40S核糖體蛋白S30（圖7）多肽鏈中間有一個明顯的親水區域；其余的核糖體蛋白多肽鏈沒有明顯的親水區域或疏水區域，親水性氨基酸分布比較均勻，且數量大于疏水性氨基酸，因此，可推斷它們屬于可溶性蛋白。

利用在線工具NetPhos 2.0 Server分別對24個核糖體蛋白的氨基酸序列進行潛在磷酸化位點分析，依據分值大于0.5的氨基酸位點都是磷酸化位點，結果列于表3。由表3可知，24個序列都具有潛在的磷酸化位點，分別位于Ser，Thr和Tyr這3個氨基酸上，其中，Ser潛在的磷酸化位點數最多。比較24個核糖體蛋白所具有的潛在磷酸化位點總數可知，50S核糖體蛋白L4的磷酸化位點數最高，為19，其次為60S核糖體蛋白L5和50S核糖體蛋白L5，分別為18和16。

表3 棗核糖體蛋白的潛在磷酸化位點

利用DNAStar軟件中的MegAlign程序對棗結果枝核糖體蛋白通過氨基酸比對構建系統進化樹，結果如圖8所示。從圖8可以看出，24個基因分為2類，50S核糖體蛋白L6為一類；而其余的核糖體蛋白為一類，包括4個亞類，每一亞類的核糖體蛋白基因可能存在于同一基因上。

利用PSORT對24個核糖體蛋白進行亞細胞定位，結果如表4所示。從表4發現，大部分核糖體蛋白定位于細胞核中。結合表4和圖8發現，在某些位于同一進化分枝上的核糖體蛋白具有不同的亞細胞定位結果，說明它們之間可能具有不同的細胞學功能，比如50S核糖體蛋白L12和40S核糖體蛋白S27，50S核糖體蛋白L4和核糖體蛋白S8e位于同一進化分枝上，但它們分別 定位在葉綠體和細胞核中。

表4 棗核糖體蛋白亞細胞定位

3 結果與討論

本研究通過對棗生長初期結果枝cDNA文庫中625個ESTs序列的測序，得到了522個有用序列，在397個與NCBI中已知功能基因相似性較高的EST中，發現了一些可能與棗樹抗寒、抗旱、抗逆性強密切相關的基因，比如超氧化物歧化酶，2-cys過氧化還原酶，過氧化物酶，抗壞血酸過氧化物酶，玉米黃質環氧化酶，shaggy蛋白激酶，親環蛋白，gast蛋白，鋁誘導蛋白，富含脯氨酸蛋白，硫氧還蛋白，熱休克蛋白等。

進一步對24條核糖體蛋白基因分析表明，核糖體蛋白屬于可溶性蛋白，分子量在6 931.12～32 764.44之間，α-螺旋和無規則卷曲是棗核糖體蛋白的主要結構元件，而β-轉角和延伸鏈則散布于整個蛋白質中。在24個核糖體蛋白中，50S核糖體蛋白L4的磷酸化位點數最高，為19。一般來說，多肽鏈中的氨基酸潛在的磷酸化位點越多，發揮更多功能的可能性就越大。本研究通過比較發現，位于葉綠體中的核糖體蛋白的磷酸化位點數普遍高于細胞質中核糖體蛋白的磷酸化位點數，這可能與數量有限的葉綠體核糖體蛋白要發揮相對更多的功能有關。通過氨基酸比對構建系統進化樹發現，同一亞類的核糖體蛋白常常具有不同的亞細胞定位結果，說明它們之間可能具有不同的細胞學功能。

［1］田媛，張俊平.核糖體蛋白的新功能及其與相關疾病的關系[J].生命科學，2011，31（ 4）：488-491.

［2］朱可可，易聰，周興濤.核糖體蛋白基因協同表達的分子機制[J].安徽農業科學，2009，37（ 35）：17376-17379.

［ 3］ Adam Amsterdam，Kirsten CSadler，Nancy Hopkins.Manuribosomal protein genesarecancergenes in zebrafish[J].Plos Biolo-gy，2004，2（ 5）：690-698.

［ 4］ Kristan K Steffen，Vivian L Mackay，Matt Kaebenriein.Yeast life span extension bydepletion of 60Sribosomal subunitsis mediated by Gcn4[J].Cell，2008，133（ 2）：292-302.

［ 5］ Alysonwmaclnnes，Adamamsterdam，Jacqueline Alees.Loss of p53 synthesis in zebrafish tumors with ribosomal protein gene mutations[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America，2008，105（ 30）：10408-10413.

［6］孟玉平，曹秋芬，孫海峰，等.棗結果枝cDNA文庫的構建與部分 ESTs分析[J].華北農學報，2009，24（ 5）：102-106.

［7］張潔，楊大威，孟玉平，等.棗樹水通道蛋白基因生物信息學分析及原核表達載體的構建 [J].山西農業科學，2010，38（ 1）：6-10.

［8］孟玉平，曹秋芬，孫海峰.棗樹ZjLFY基因cDNA片段的克隆與表達分析[J].果樹學報，2010，27（ 5）：719-724.

［9］孟玉平，曹秋芬，孫海峰.棗樹花分生組織特異基因ZjAP1的克隆與表達分析[J].山西農業科學，2010，38（ 2）：6-11.

［10］郝子琪，許洪仙，孟玉平，等.棗樹抗壞血酸過氧化物酶基因ZjAPX生物信息學分析及植物表達載體的構建[J].山西農業科學，2011，39（ 5）：400-403.

［11］王長彪，郭旺珍.與棉纖維發育相關的EST生物信息學分析[D].南京：南京農業大學，2007.

［12］鐘增明，李世東，高會蘭，等.鏈孢粘帚霉寄生核盤菌菌核相關基因的EST生物信息學分析 [J].中國生物防治學報，2011，27（ 2） ：207-213.

［13］趙大球，曹春燕，孔芬，等.植物β-胡蘿卜素羥化酶的生物信息學分析[J].生物技術通報，2010（ 4）：116-121.

［14］吳春太，李維國，高新生，等.植物DNA甲基轉移酶的生物信息學分析[J].西南大學學報：自然科學版，2010，32（ 4）：83-89.

［15］李愛芹，李利斌，劉國明.一個番茄細胞分裂素受體類激酶基因的生物信息學分析 [J].天津農業科學，2009，15（5）：1-3.

［16］柯濤，毛晗，惠豐立，等.油料作物EST資源的生物信息學分析[J].生物信息學，2010，8（ 2）：165-174.

［17］薛永常，聶會忠，劉長斌.木質素合成酶C3H基因的生物信息學分析[J].生物信息學，2009，7（ 1）：13-17.

［18］林元震，郭海，黃少偉，等.火炬松DREB1基因的電子克隆與生物信息學分析[J].生物信息學，2010，8（ 1）：43-46.