核桃內生菌HT3對番茄和黃瓜的促生作用

王美琴，盧海波，趙立娟，郝曉娟

（1.山西農業大學農學院，山西太谷030801；2.祁縣峪口鄉人民政府，山西祁縣030900）

隨著社會生產力的發展，人們對生活環境質量愈來愈關注，對綠色食品的要求亦愈迫切，這就不可避免地要求限制化學農藥的使用量及應用范圍。近年來，應用微生物代替（或部分代替）化肥和農藥，越來越受到各國政府及學者的高度重視[1]。植物內生菌與寄主植物在長期共同進化過程中形成了密切的相互關系，且生存微環境穩定，成為化肥、農藥和其他微生態制劑的最佳競爭者，其合理應用將減少化學農藥造成的環境污染、提高農田生態系統的生物多樣性和有利于保持生態平衡[2-4]。據報道，植物內生菌的代謝產物中具有促進植物生長的物質如植物生長素、乙烯、赤霉素和細胞分裂素等，可直接促進植物生長。Sturz等[5]對從馬鈴薯和紅三葉草中分離的內生細菌研究發現，有21%對寄主生長有促進作用，13%對寄主生長表現為抑制作用。Tien等[6]就內生細菌對植物促生作用的機制進行研究，結果表明，內生細菌可以通過生物固氮或產生植物激素直接促進植物生長；Lazarovits等[7]證明，內生細菌可以通過誘導寄主植物產生植物激素；何紅等[8]在研究內生枯草芽孢桿菌BS-1，BS-2菌株對辣椒和白菜促生作用機制中也發現，用菌株培養液浸種后，導致植株體內生長素（IAA）、赤霉素（ GA3）和玉米素（ ZR4）等植物內源激素含量增加，脫落酸（ABA）含量下降。Xu等[9-10]研究表明，內生細菌還可以通過改變寄主植物對霜凍等有害環境條件及有害病原生物的敏感性或防止植物病害的發生等促進植物生長。

為了研究山西農業大學農學院植物病害生防作用課題組分離篩選出的對核桃腐爛病菌具有拮抗作用的內生菌株HT3是否具有促生功能，本試驗研究了該菌株代謝產物對番茄、黃瓜種子萌發和幼苗生長的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

細菌培養用牛肉膏蛋白胨培養基（NA），即蛋白胨7.5 g，牛肉浸膏3.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.2。 不加瓊脂為液體培養液（NB）。

內生菌HT3是由山西農業大學植物病理實驗室從健康的核桃枝條中分離篩選出的拮抗菌株。供試作物種子為番茄（海紅一號）和黃瓜（津研四號）。

1.2 內生菌HT3培養濾液的制備

核桃內生菌HT3在NA斜面培養基上培養24 h后，取兩環接種于裝液量為100 mL、體積為250 mL的錐形瓶，置于28℃，160 r/min，振蕩培養48 h即為菌株培養液，再置于18 000 r/min的離心機上離心15 min，其上清液用直徑0.45μm過濾膜過濾后，過濾液在4℃的條件下進行保存備用。

1.3 內生菌株HT3培養濾液對番茄、黃瓜種子萌發的影響

將1.2制備的培養濾液原液用無菌水分別稀釋為 1.25，2，5，10，20，100倍。 將黃瓜、番茄種子分別浸泡在不同倍數的稀釋濾液中12，24 h后，放在鋪有濾紙的無菌培養皿中，每皿放20粒種子，每個處理3次重復，在25℃的恒溫箱中培養，每天按時用無菌水補足水分以保持濾紙潮濕。3 d后觀察和記錄種子的發芽率以及胚芽生長量。以空白培養液的離心上清液作為對照[11-12]。

1.4 內生菌株HT3培養濾液對黃瓜、番茄幼苗生長的影響

分別用稀釋10倍的HT3培養濾液、NB培養液和無菌水浸泡黃瓜和番茄種子12 h，然后播種于無菌土花盆中，每盆播種15粒，每處理重復3次，置于人工氣候箱中培養（白天25℃，晚上20℃），出苗后調查出苗率。每盆選大小一致的10株苗（其余的剔除），于播種后20 d分別測定其株高、莖粗、根長及植株的鮮質量，植株干質量于80℃烘干3 h后稱量[13-14]。

2 結果與分析

2.1 內生菌HT3培養濾液對番茄、黃瓜種子發芽率的影響

試驗結果表明，種子的發芽率與培養濾液的稀釋倍數、浸泡時間沒有相關性，在所測試的稀釋倍數范圍內，種子的萌發率與對照相比，差異不顯著。

2.2 內生菌HT3培養濾液對番茄、黃瓜種子胚芽生長量的影響

由圖1可知，用不同稀釋倍數的菌株HT3培養濾液處理的番茄、黃瓜種子都能夠正常發芽生長，但不同稀釋倍數對胚芽的生長量影響不同。HT3培養濾液在稀釋5～100倍之間對番茄、黃瓜種子的萌發具有明顯地促生作用，在這一稀釋倍數范圍內胚芽的生長量明顯大于對照，當培養濾液稀釋10倍時，番茄和黃瓜種子胚芽的生長量分別為對照的215%和142%；當稀釋倍數小于5倍時，對胚芽的生長出現了抑制作用，并隨著稀釋倍數的降低抑制作用愈來愈強。當稀釋1.25倍時，種子不萌發。

2.3 番茄種子在內生菌HT3培養濾液中浸泡不同時間后胚芽和胚根的生長量

從圖2可以看出，內生菌HT3稀釋10倍的培養濾液浸泡番茄種子后，胚根和胚芽的生長量均顯著大于對照，種子浸泡12 h后，無論是胚芽的生長量還是胚根的生長量都明顯高于浸泡24 h。12 h處理的種子胚芽長度為31.5 mm，24 h處理的種子胚芽長度為29.3 mm。

2.4 內生菌HT3培養濾液對番茄和黃瓜種子幼苗的促生作用

從表1可以看出，稀釋10倍的HT3培養濾液浸種處理對幼苗生長有明顯的促生作用，與對照相比差異顯著，增加了番茄和黃瓜幼苗的平均鮮質量和干質量，且與對照相比，增加均達到130%以上；番茄和黃瓜幼苗的平均株高與對照相比，分別增加31.66%和68.02%，平均莖粗與對照相比，分別增加86.54%和69.35%。結果還表明，空白NB培養液浸種對番茄和黃瓜幼苗的生長雖然與菌株培養濾液相比差距大，但與無菌水相比均有不同程度的促進作用，可見空白NB培養液中的營養成分也可促進種子的萌發。

表1 內生菌HT3培養濾液對番茄和黃瓜幼苗的促生作用

3 結論與討論

關于植物內生菌的促生作用國內已有許多相關的報道，涉及的植物有農作物、蔬菜及水果等各個領域[11-16]。本試驗結果表明，核桃內生菌HT3菌株對番茄和黃瓜種子的萌發和幼苗的生長都具有明顯促生作用。菌株培養濾液處理的番茄和黃瓜植株苗比清水處理的健壯、葉片大、葉色濃綠、莖稈粗、根毛長。菌液處理的種子萌發后胚芽和胚根的生長量都明顯高于對照，但不同稀釋倍數的菌株培養濾液對種子的促生作用是不同的。當稀釋倍數太低時反而對種子萌發有抑制現象，出現這種現象的原因可能是由于內生菌代謝產物——生長激素類物質高造成的。所以，在利用內生菌作為生物肥料時，應將內生細菌的有效含量控制在一定范圍內。同時結果顯示，內生菌的培養液對種子浸泡12 h后的促生作用更好。種子的發芽率與是否經過培養液的處理之間沒有相關性，本試驗中所使用的內生菌在稀釋倍數大時，對番茄和黃瓜種子沒有明顯的毒害作用。關于菌株HT3的生防作用方面還未見報道，山西農業大學農學院核桃內生菌對植物病害生防作用課題組前期研究表明，該菌株對多種病原菌具有抑制作用，有關該菌株的其他方面如生物活性物質的主要成分及分子結構、在田間的生防作用及促生功能受環境因素的影響等還有待于研究。本研究為具有防病、促生、固氮等多功能菌株的開發應用和植物病害的生物防治提供了有用的資源。

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