順鉑聯合熱療對人胃癌耐藥細胞增殖及耐藥相關基因Survivin表達的影響

董 倩 陳 虎(河北醫科大學第四醫院化療科，河北 石家莊 0500)

腫瘤產生多藥耐藥(MDR)是化療失敗的重要原因之一，尋找能夠逆轉耐藥的方法成為當前的重要研究方向之一。目前發現熱療可能通過不同的作用機制，抑制腫瘤的生長，逆轉腫瘤耐藥，從而對化療起到協同和增效的作用〔1〕。本研究通過順鉑聯合熱療作用于人胃腺癌耐藥細胞株SGC7901/DDP，并觀察其對細胞增殖及Survivin表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃腺癌耐藥細胞株SGC7901/DDP(購買于南京凱基生物有限公司)，置于RPMI1640培養液中，加入濃度為1 μg/ml的順鉑(山東齊魯制藥有限公司產品，批號是9080372DC)以維持耐藥性。兔抗人Survivin多克隆抗體(河北博海生物工程開發有限公司)。

1.2 分組 取對數生長期細胞，常規胰蛋白酶消化后，以5.0×105/瓶接種于25 ml培養瓶中，培養24 h待細胞貼壁后，用含順鉑0.1 μg/ml的RPMI1640培養基換液。熱療組、熱化療組在43℃恒溫水浴箱中加熱2 h后，與對照組、化療組同時繼續于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養至24 h。常規消化收集細胞，PBS液離心洗滌2遍，用70%冷乙醇(4℃)固定;調整細胞濃度為1.0×106/ml，取 1 ml單細胞懸液，加入兔抗人Survivin抗體 0.1 ml(工作濃度1∶50)，室溫孵育 30 min，PBS液洗3次;分別加入羊抗兔 IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，PBS液洗3次后上機檢測。設PBS代替一抗和二抗的陰性對照以及只加二抗的本底對照。

1.3 方法

1.3.1 FCM法檢測細胞周期分布和細胞凋亡 取對數生長期細胞，用PBS液洗滌2次，再用鹽水洗滌2次，棄去上清，加入溴化丙啶1 ml染色，冰浴30 min，銅網過濾制成單細胞懸液，用流式細胞儀對細胞的DNA定量分析，計算出細胞周期的時相分布和凋亡率，按公式計算增殖指數(PI)。

1.3.2 FCM法半定量檢測細胞的Survivin蛋白的表達 取對數生長期的細胞，各組均重復3瓶。常規消化收集細胞，PBS液離心洗滌2次，用70%冷乙醇(4℃)固定;調整細胞濃度為1.0×106/ml，取1 ml單細胞懸液，加入兔抗人 Survivin抗體0.1 ml(工作濃度1∶50)，室溫孵育30 min，PBS液洗3次;分別加入羊抗兔IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，PBS液洗3次后上機檢測。設PBS代替一抗和二抗的陰性對照，以及只加二抗的本底對照。以熒光指數(FI)表示蛋白表達的相對含量。均道值(平均熒光強度)=lg(測量值)×340。FI=實驗樣品均道值/對照樣品均道值。

1.3.3 RT-PCR法半定量檢測細胞的Survivin mRNA表達 取對數生長期細胞，各組均重復3瓶。用Trizol提取總RNA，電泳進行總 RNA完整性檢測。各取2 μl測其260 nm和280 nm光密度值(OD260 nm和OD280 nm)，比值在1.8～2.0之間，說明RNA純度較高，可進行下一步檢測。將各組RNA標本逆轉錄生成cDNA，PCR反應檢測各組細胞Survivin基因的轉錄情況。以GAPDH作為內參，片段長度為452 bp，上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCACT-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。反應條件為94℃ 5 min，94℃ 1 min，64℃ 40 s，72℃ 30 s，循環35次。設計 Survivin片段大小為447 bp，上游引物 5'-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3'，下游引物5'-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3'，反應條件為 94℃ 2 min，94℃ 45 s，68℃ 45 s，72℃ 1 min，循環35次。上述PCR擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳。應用1D Image Analysis Software進行表達強度分析，同時以GAPDH作為內參照。相對系數=細胞PCR產物表達強度/GAPDH表達強度。

1.4 統計學分析 采用SPSS11.0統計軟件包，計量資料以±s表示，符合正態分布的計量資料組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 各組FCM檢測細胞增殖的比較 與對照組相比，化療組各細胞周期無明顯變化(P＞0.05)。熱療組、熱化療組G0/G1期的細胞比例逐漸提高，而S期的細胞比例明顯降低(P＜0.05)。與對照組及化療組相比，熱療組G2/M其細胞比例增多，但不具有顯著性(P＞0.05)。熱化療組相比各組各期細胞比例變化均具有顯著性差異(P＜0.05)。與對照組相比，化療組、熱療組PI雖然有所降低，但無顯著性差異(P＞0.05)，而熱化療組與各組相比PI明顯降低(P＜0.05)。見表1。

2.2 各組細胞Survivin蛋白表達的比較 對照組、化療組、熱療組、熱化療組Survivin FI值分別為:1.000±0.000，1.011±0.016，0.736 ±0.008，0.629 ±0.022。與對照組相比，化療組 FI值無顯著性差異(P＞0.05)，而熱療組、熱化療組的GST-π蛋白表達的FI值逐步降低，并均具有顯著性差異(P＜0.01)。

表1 各組細胞周期及PI變化(±s，%，n=3)

表1 各組細胞周期及PI變化(±s，%，n=3)

1)與對照組比較;2)與化療組比較;3)與熱療組比較:均P＜0.05

組別 G0/G1 S G2/M PI對照組 43.81±2.11 40.30±0.80 15.89±2.56 84.11±2.56化療組 43.65±2.28 40.38±0.77 15.97±3.04 84.03±3.04熱療組 48.20±0.291)2)34.50±1.501)2) 17.30±1.79 82.70±1.79熱化療組 61.16±1.651)2)3)16.68±0.851)2)3)22.16±2.311)2)3)77.84±2.321)2)3)

2.3 各組細胞的Survivin mRNA表達的比較 對照組、化療組、熱療組、熱化療組 Survivin mRNA半定量值分別為:15.367 ±0.702，15.833 ±0.702，7.600 ±0.436，5.600 ±0.500。與對照組相比，化療組無顯著差異(P＞0.05)，而熱療組、熱化療組Survivin mRNA表達逐步降低，并均有極顯著差異(P＜0.01)。

3 討論

MDR的產生歸因于許多因素，包括細胞內藥物外排及胞內藥物重分布、啟動細胞內解毒系統、拓撲異構酶II蛋白含量及活性下降，DNA的修復損傷能力增強、細胞抗凋亡機制的參與等。

熱誘導細胞凋亡是熱療殺傷腫瘤細胞的主要機制〔2，3〕。Zhang等〔4〕研究顯示奧沙利鉑對腫瘤細胞的生長抑制作用具有溫度依賴性，發現在50 μg/ml的奧沙利鉑作用下，43℃對腫瘤細胞的抑制作用最強。并且研究表明熱療可引起G0/G1期細胞周期阻滯，并通過上調P53，Bax表達和下調 Bcl-2來促進Lovo細胞凋亡。Walther等〔5〕通過體內外41℃ ～43℃加熱處理人類結腸癌細胞HCT15和HCT16后，運用酶聯免疫吸附試驗測定熱療前后TNF-α和多藥耐藥基因抑制基因(CAT)的表達，結果表明TNF-α分泌和CAT表達顯著增強，P糖蛋白(P-gp)、多藥抗藥性相關蛋白(MRP)和肺多藥抗藥性相關蛋白(LRP)表達均顯著減弱，這在一定程度上提示，熱化療可以抑制P-gp和MRP表達，逆轉腫瘤多藥耐藥性。

本研究發現熱療及順鉑聯合熱療都可以使人胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP的G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，并且順鉑聯合熱療作用效果最明顯。這可能是熱療將細胞抑制于G1期，而G1期正是化療藥物作用的敏感點〔6〕，所以逆轉了耐藥腫瘤細胞對化療的敏感性。

Survivin是細胞凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，具有抑制細胞凋亡的作用，在腫瘤的形成過程中起著關鍵的作用〔7〕。它廣泛表達于人的胚胎組織和各種腫瘤組織，但在正常成人分化組織中(胸腺、生殖器除外)檢測不到。Survivin mRNA在細胞周期中的G2/M期特異性高表達，其過度表達若超越細胞自身的周期調控時，就會導致腫瘤的形成;相反，Survivin基因缺失的細胞也不能正常進行細胞分裂〔8，9〕。多項研究發現〔10，11〕，抑制Survivin的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖，并且能夠增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。

本研究中，單純熱療及順鉑聯合熱療作用后，SGC7901/DDP細胞中Survivin蛋白及mRNA的表達明顯的下降，并且并順鉑聯合熱療作用后下降最明顯。由此推測，熱療可能通過抑制Survivin蛋白的生成及Survivin mRNA的表達，來增強耐藥腫瘤細胞對化療的敏感性。

綜上，熱療聯合順鉑化療對人胃癌耐藥細胞SGC7901/DDP具有明顯的抑制作用，然而腫瘤耐藥的機制是復雜的，熱療逆轉腫瘤耐藥的機制需要進一步研究。

1 董 倩，陳 虎，孔 雁，等.腫瘤熱化療研究進展〔J〕.腫瘤研究與臨床2009;21(7):499-501.

2 Rong Y，Mack P.Apoptosis induced by hyperthermia in Dunn osteosarcoma cell line in vitro〔J〕.Int J Hyperthermia，2000;16(1):19-27.

3 Ashush H，Rozenszajn LA，Blass M，et al.Apoptosis induction of human myeloid leukemic cells by ultrasound exposure〔J〕.Cancer Res，2000;60(4):1014.

4 Zhang XL，Hu AB，Cui SZ，et al.Thermotherapy enhances oxaliplatin-induced cytotoxicity in human colon carcinoma cells〔J〕.World J Gastroenterol，2012;18(7):646-53.

5 Walther W，Stein U，Schlag PM.Use of the human MDR1 promoter for heat-inducible expression of therapeutic genes〔J〕.Int J Cancer，2002;98(2):291-6.

6 Shao J，Lee SB，Guo H，et al.Prostaglandin E2 stimulates the growth of colon cancer cells via induction of amphiregulin〔J〕.Cancer Res，2003;63(17):5218-23.

7 Altieri DC.Survivin and IAP proteins in cell-death mechanisms〔J〕.Biochem J，2010;430(2):199-205.

8 Wen YZ，Zhao NJ，Zhi NY，et al.Survivin siRNA inhibits gastric cancer in nude mice〔J〕.Cell Biochem Biophys，2012;62(2):337-41.

9 Kelly RJ，Lopez-Chavez A，Citrin D，et al.Impacting tumor cell-fate by targeting the inhibitor of apoptosis protein survivin〔J〕.Mol Cancer，2011;10:35.

10 方 雷，吳海濱，陳曉崗.Survivin基因沉默抑制胃癌MGC-803細胞增殖并增強其對塞來昔布的敏感性〔J〕.南方醫科大學學報，2011;31(11):1944-8.

11 Shen X，Zheng JY，Shi H，et al.Survivin knockdown enhances gastric cancer cell sensitivity to radiation and chemotherapy in vitro and in nude mice〔J〕.Am J Med Sci，2012;344(1):52-8.