海南地區APM-1基因多態性與腦梗死患者血清脂聯素水平的相關性

何 平 丁毅鵬 陳曉玲 (海南省人民醫院急救中心，海南 海口 570311)

在缺血性腦卒中類型中動脈粥樣硬化性腦梗死(ACI)則較為常見〔1，2〕。研究證實在腦卒中的發病過程中遺傳因素起著重要的作用，因而尋找其易感基因則是目前國內外學者的研究熱點〔3〕。脂聯素是一種脂肪因子，通過與脂聯素受體結合后有著抗炎、抗動脈粥樣硬化及提高胰島素敏感性等作用。本研究探討海南地區漢族人群中ACI的脂聯素APM-1基因多態性與血清脂聯素水平、血脂血壓的關系，進一步認識ACI的分子遺傳機制。

1 資料與方法

1.1 入選標準 ACI診斷以全國第四屆腦血管疾病會議修訂的腦梗死診斷標準，收集到ACI患者120例(男78例，女42例)，平均年齡為(58.43±10.86)歲，平均體重指數(BMI)為(26.28±2.59)kg/m2，120例正常對照者(男60例，女60例)，年齡范圍(57.96±9.52)歲，平均 BMI(23.10±2.14)kg/m2。其中 ACI組患者有高血壓史者為89人，占組內總人數74.17%;有糖尿病史者為31人，占組內總人數25.83%。而對照組中有高血壓史者為18人，占組內總人數15%;有糖尿病史者為4人，占組內總人數3.33%。健康體檢者為對照組120例，無血緣關系，同時排除有冠心病、心腦血管疾病家族史、肝腎疾病、自身免疫性疾病、血液病、妊娠、半年內有過降脂治療者。ACI組:住院病人120例，同樣也無任何血緣關系。符合全國第四屆腦血管疾病會議修訂的腦梗死診斷標準，并經頭顱CT或(和)MRI確診。排除其他疾病引起的腦梗死。

1.2 DNA制備 受試者常規禁食12 h后，于次日7:00～8:00采靜脈血5 ml，采用構椽酸鈉抗凝，利用常規酚/氯仿抽提法提取DNA。

1.3 引物設計 引物采用PrimerPremier5.0軟件設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，測序由上海申能博彩生物技術有限公司完成。PCR引物序列為5'-CTGAGATGGACGGAGTCCTTT-3'，5'-CCAAATCACTTCAGGTTGCTT-3'，片段長度為456 bp。

1.4 基因測序 采用PCR-RFLP結合測序技術進行基因型分析。所有酶切產物以2%瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳后應用GIS凝膠圖像處理系統觀察結果。

1.5 血清脂聯素水平測定 采用雙抗夾心酶聯免疫吸附試驗，上海美季生物技術有限公司提供試劑盒，按說明書操作。

1.6 統計學分析 應用SPSS13.0軟件，采用HWE軟件檢驗基因型的Hardy-Weinberg平衡吻合度，以基因計數法計算ACI組和對照組基因型和等位基因頻率。計數資料比較采用χ2檢驗。計量資料比較采用t檢驗，兩組以上比較采用方差分析。

2 結果

2.1 SNP45T/G及SNP276G/T的測序情況 見圖1，圖2。

圖1 SNP45T/G測序情況

圖2 SNP276G/T測序情況

2.2 ACI患者各血脂指標及脂聯素水平的比較 ACI組中的總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)血清水平與對照組相比較，均有顯著的升高(P＜0.001)，ACI組中的高密度脂蛋白(HDL)及脂聯素各自的血清水平與對照組相比較，有明顯的降低，P ＜0.001。見表1。

表1 血脂及脂聯素血清學檢測比較(n=120，±s)

表1 血脂及脂聯素血清學檢測比較(n=120，±s)

組別TC(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)脂聯素(μg/ml)ACI組1.88±1.51 1.19±0.25 3.23±0.73 4.1±1.5對照組 1.40±1.29 1.34±0.41 2.80±0.52 7.0±3.3 t值 7.01 11.71 27.62 76.80 P值0.009 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 脂聯素SNP45位點各基因型與血清脂聯素關系分析 在ACI組的APM-1 SNP45的T/T、G/T及G/G三種基因型中，脂聯素的血清水平分別為(3.92±1.2)、(4.07±1.5)及(3.99±1.4)μg/ml(t=0.287，P=0.593)。同樣，對照組各基因型差異也無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 脂聯素SNP45位點各基因型與血清脂聯素關系比較(n=120，±s)

表2 脂聯素SNP45位點各基因型與血清脂聯素關系比較(n=120，±s)

組別APM-1 SNP45 T/G各基因型血清脂聯素(μg/ml)T/T G/T G/G t值 P值ACI組3.92±1.2 4.07±1.5 3.99±1.4 0.287 0.593對照組7.12±3.3 6.88±2.7 6.96±2.8 0.150 0.700

2.4 脂聯素SNP276位點各基因型與血清脂聯素關系分析在ACI組的APM-1 SNP276的 T/T、G/T及G/G三種基因型中，脂聯素的血清水平分別為(4.07±1.6)、(4.01±1.4)及(3.38±0.7)μg/ml，G/G基因型與T/T基因型比較差異顯著(t=29.53，P＜0.001);而對照組各基因型的差異無統計學意義(P=0.434)。對照組G/G基因型的血清脂聯素與其他兩種基因型比較，也有所降低，而在ACI組，G/G基因型的血清脂聯素降低較其余兩種基因型更為顯著，由此推斷，攜帶G/G基因型可能增加ACI患病的風險。見表3。

表3 脂聯素SNP276位點各基因型與血清脂聯素關系比較(n=120，±s)

表3 脂聯素SNP276位點各基因型與血清脂聯素關系比較(n=120，±s)

組別APM-1 SNP45 T/G各基因型血清脂聯素(μg/ml)T/T G/T G/G t值 P值ACI組4.07±1.6 4.01±1.4 3.38±0.7 29.53 ＜0.001對照組6.93±2.8 6.84±2.6 6.01±2.2 0.618 0.434

3 討論

于1995年Scherer等〔4，5〕發現的一種結構類似于補體因子q的蛋白質，而由脂肪細胞特異性分泌的物質，后來命名為脂聯素。脂聯素通過抑制血管內皮細胞炎癥發生及白細胞的黏附，并且抑制血管平滑肌的遷移和增殖，從而抑制動脈粥樣硬化的形成。脂聯素還可以降低肝臟和肌肉的甘油三酯的含量，提高脂肪酸的氧化，改善脂代謝，協助增強抗動脈粥樣硬化的作用。

脂聯素是如何抑制動脈粥樣硬化形成的機制尚未清楚。內皮細胞損傷被認為是動脈粥樣硬化的病理改變初期。Ouchi等〔6〕用經脂聯素處理后的人主動脈內皮細胞研究發現，脂聯素對巨噬細胞的形成及吞噬細胞作用以及單核細胞的黏附都有一定的影響，表現在拮抗腫瘤壞死因子(TNF)-α的生成與發生作用。內皮細胞被TNF-α激活后，通過NF-κB信號通路使黏附分子如VCAM-1、ICAM-1及E-selectin的mRNA表達上調，使得單核細胞黏附于內皮細胞表面增多，形成動脈粥樣斑塊，這是動脈粥樣硬化疾病發生、發展的關鍵步驟。

人脂聯素基因(APM-1)進行序列分析后發現，APM-1在正常人中存在一定數量的等位基因SNPs，其編碼蛋白質的氨基酸序列不受密碼子改變的影響。到現在為止發現了分布在APM-1上游啟動子、內含子與外顯子等多個區域的十多種ADP常見的 SNPs及一些罕見的錯義突變〔7，8〕。

本文結果顯示海南漢族人群中，ACI患者血清脂聯素水平明顯低于健康人群，ACI患者APM-1 SNP276位點多態性與血清脂聯素水平有關，G/G基因型個體的血清脂聯素水平較低，攜帶APM-1 SNP276 G/G基因型可能增加ACI患病的風險。

1 張 成，劉焯霖.重視腦血管病的遺傳學研究〔J〕.中華神經科雜志，1999;32(5):262-4.

2 Adamczak M，Wiecek A，Funahashi T，et al.Decreased plasma adiponectin concentrations in patients with essential hypertension〔J〕.Am J Hypertens，2003;16(1):72-5.

3 畢 楠.一個新的脂肪因子——脂聯素的結構與功能的研究進展〔J〕.中國動脈硬化雜志，2005;13(4):520-2.

4 Yan WL，Chen SF，Huang JF，et al.Common SNPs of APM-Ⅰ gene are not associated with hypertension or obesity in Chinese population〔J〕.Biomed Environ Sci，2006;19(3):179-84.

5 Hegener HH，Lee IM，Cook NR，et al.Association of adiponectin gene variations with risk of incident myocardial infarction and ischemic stroke:a nested case-control study〔J〕.Clin Chem，2006;52(11):2021-7.

6 Ouchi N，Kihara S，Arita Y，et al.Adiponectin，an adipocyte-derived plasma protein，inhibits endothelial NF-κB signaling through a camp-dependent pathway〔J〕.Circulation，2000;102(11):1296-301.

7 Hara K，Boutin P，Mori Y，et al.Genetic variation in the gene encoding adiponectin is associated with an increased risk of type 2 diabetes in the Japanese population〔J〕.Diabetes，2002;51(12):536-40.

8 Vasseur F，Helbecque N，Dina C，et al.Single-nucleotide polymorphism haplotypes in the both proximal promoter and exon 3 of the APM-1 gene modulate adipocyte-secreted adiponectin hormone levels and contribute to the genetic risk for type 2 diabetes in French Caucasians〔J〕.Hum Mol Genet，2002;11(21):2607-14.