蒲公英水提物對大鼠潰瘍性結腸炎的治療作用

陳玉杰 (濟寧醫學院基礎醫學與法醫學院，山東 濟寧 272067)

潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性病因不明的非特異性腸道炎癥，難以治愈、易復發，其病因、發病機制以及治療藥物研究一直是研究的熱點〔1〕。蒲公英(HT)含有多種有效成分，具有抗炎、免疫調節等作用〔2〕。本文采用三硝基苯磺酸(TNBS)制備UC模型，探討蒲公英水提物對UC的治療作用。

1 材料與儀器

1.1 動物 健康SD大鼠62只，雌雄各半，體重(250±20)g，鄭州大學動物實驗中心提供，合格證號為SCXK(豫)2008-0001。

1.2 試藥 HT濟寧醫學院藥學院提供，劉善庭教授鑒定為藥用 HT(T.offtcinale F.H.Wigg);TNBS(Sigma，批號 20090212)，用400 ml/L乙醇溶液將TNBS配制成50 g/L的溶液;柳氮磺胺吡啶(SASP，上海三維制藥有限公司，批號:20090812);白細胞介素(IL)-8、IL-10、腫瘤壞死因子(TNF)-α、核轉錄因子(NF)-κB(批號 100107，100209，090501，100412)，試劑均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 酶聯免疫(ELLSA)檢測儀(美國熱電-芬蘭雷勃酶標儀，型號 MK3);BP-190S電子天平(德國 Sartorius公司);Beckman臺式高速離心機(Beckman公司)。

1.4 方法

1.4.1 HT的煎煮 HT加10倍量水，煎煮1 h，煎煮2次，過濾，合并2次濾液，濃縮至每毫升相當于1 g原藥材，同時稀釋成所需要濃度。

1.4.2 UC模型的建立 選取SD大鼠52只，采用TNBS/乙醇法造模，烏拉坦麻醉大鼠，將直徑2 mm，長約12 cm的塑膠管由大鼠肛門輕緩插入深約8 cm處，將TNBS按100 mg/kg推入大鼠結腸，誘導UC的形成〔3〕。模型制備10 d后，隨機選取2只處死，剖腹摘取直腸和結腸，0.9%氯化鈉清洗后肉眼可見結腸腸壁充血、水腫，內壁紋理模糊，病理切片可觀察到大量炎細胞浸潤，黏膜損傷等病理改變。確定造模成功。適應性飼養1 w。

1.4.3 分組和給藥 造模后的50只大鼠，隨機分成模型組，HT水提物高、中、低劑量治療組，柳氮磺胺吡啶陽性對照組(SASP組)，另設正常對照組，每組10只，HT低、中、高劑量治療組分別50、100、150 mg/kg給藥，SASP組每次400 mg/kg給藥，灌胃，1次/d，2 ml/次，連續14 d。正常對照組和模型組給予2 ml蒸餾水。

1.4.4 標本采集 末次給藥后，禁食不禁水12 h，斷頭取血，取全血標本2 ml于試管中，以4 000 r/min轉速離心15 min取血清，于-20℃冰箱冷凍保存。取結腸組織，中性甲醛固定，進行肉眼大體形態評分，腸組織部分石蠟包埋，病理切片做蘇木素-伊紅(HE)染色。

1.4.5 大體形態及組織學評分 大體形態按Ekstrom〔4〕標準進行評分，組織學評分參照 Dieleman等〔5〕標準，根據結腸潰瘍深度、范圍、炎癥程度進行評分。

1.4.6 檢測指標及方法 ELISA法測定血清 IL-6、IL-10、TNF-α水平。免疫組化染色(SP法)檢測NF-κB p65表達，采用圖像分析，計數鏡下單位面積內的平均陽性細胞數量，評估染色強度和陽性細胞數量分級，染色積分為兩者乘積〔6〕。

1.5 統計學方法 采用SPSS16.0軟件。計數資料以百分率表示，統計分析采用χ2檢驗。計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 各組大體形態評分和病理組織學評分 與正常對照組比較，模型組結腸黏膜明顯充血、水腫、糜爛和潰瘍;病理學檢查可見炎性細胞浸潤，上皮細胞脫落形成淺潰瘍，模型組組織大體評分和病理組織學評分明顯升高(P＜0.01);與模型組比較，SASP和中、高劑量組大體評分和病理組織學評分明顯下降(P＜0.05)，潰瘍數量減少，充血水腫減輕，伴少量炎性細胞浸潤。見表1。

2.2 HT水提物對UC大鼠 IL-6、IL-10、TNF-α水平的影響與正常對照組比較，模型組血清IL-6、TNF-α、NF-kBp65陽性細胞含量明顯升高(P＜0.01)，IL-10含量明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，SASP組和中、高劑量組TNF-α、IL-6、NF-kBp65陽性細胞含量含明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，IL-10含量明顯升高(P＜0.05)。與SASP組比較，高劑量治療組與SASP療效相當(P＞0.05)。見表2。

表1 大鼠結腸組織大體形態和病理組織評分(n=10，±s)

表1 大鼠結腸組織大體形態和病理組織評分(n=10，±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05

組別 大體形態評分 病理組織學評分正常對照組0±0 1.03±0.29模型組 7.59±0.271) 11.97±1.331)SASP組 4.76±0.312) 8.29±0.572)HT低劑量組 7.11±0.32 10.07±1.27中劑量組 6.29±0.292) 9.44±1.072)高劑量組 4.98±0.392) 8.19±1.282)

表2 HT水提物對UC大鼠IL-6、IL-10、TNF-α、NF-kBp65陽性細胞含量的影響(n=10，±s)

表2 HT水提物對UC大鼠IL-6、IL-10、TNF-α、NF-kBp65陽性細胞含量的影響(n=10，±s)

與正常對照組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與模型組比較:3)P＜0.01

組別 IL-6(ng/L) IL-10(ng/L) TNF-α(ng/L) NF-kBp65陽性細胞(%)正常對照組 52.67±10.33 40.21±5.37 31.39±9.27 0.21±0.27模型組 88.31±16.471) 18.39±4.551) 71.27±8.811) 0.41±0.081)SASP組 61.17±11.642) 36.74±4.573) 35.71±8.293) 0.27±0.033)HT低劑量組 81.47±14.17 21.61±5.39 64.18±8.98 0.38±0.041中劑量組 73.57±12.432) 26.17±4.53 46.29±9.322) 0.35±0.052)高劑量組 69.54±15.112) 34.17±4.192) 36.27±8.353)0.30±0.034

3 討論

目前，免疫調節異常在UC發病中作用日益受到重視，促炎細胞因子與抗炎細胞因子參與了免疫反應和炎癥過程，相互作用失去平衡，繼之導致結腸組織免疫損傷，從而產生一系列臨床癥狀。TNF-α、IL-6和IL-10作為重要的促炎性及抑炎性因子，與UC密切相關。TNF-α作為一種重要的免疫介質，常與T淋巴細胞以及其他一些因子構成復雜的免疫調節網絡〔7〕，募集中性粒細胞至炎癥局部，誘發水腫和肉芽腫形，TNF-α還可通過激活NF-κB通路，上調IL-6等促炎介質表達，使早期炎癥遷延〔8〕。IL-10為一種抑炎性細胞因子，可抑制IL-6等炎癥細胞因子合成，對UC具有保護作用。血漿IL-10濃度降低，導致細胞因子的相互作用失衡，加大炎性反應，促使潰瘍的形成。

HT水提液降低癌細胞活性，發揮抗腫瘤作用，并在有效預防化學致癌方面有很大的發展前景，可安全用于臨床腫瘤治療，增強動物免疫功能。并能有效清除超氧陰離子自由基、羥自由基〔9〕。本研究顯示HT水提物能通過調節細胞因子的水平使腸黏膜免疫調節紊亂得以恢復，促進潰瘍愈合。

綜上所述，HT水提物具有促進UC腸黏膜修復、抑制機體炎癥和恢復免疫平衡的作用，其作用機制可能與抑制TNF-α、IL-6和NF-κB，上調IL-10水平有關。

1 于小華，劉曉華，趙浩如，等.腸安寧膠囊對大鼠潰瘍性結腸炎的實驗研究〔J〕.中國醫科大學學報，2010;41(6):563-7.

2 姜 寧，宋新波.蒲公英的藥理研究進展〔J〕.中國中醫藥志，2008;12(6):19-20.

3 奚苗苗，張三奇，顧 宜，等.果膠-酮洛芬前藥對大鼠實驗性潰瘍性結腸炎的治療作用〔J〕.第四軍醫大學學報，2009;30(13):1231-4.

4 Ekstrom GM.Oxazolone-induced colitis in rats:effects of budesonide，cyclosporin A，and 5-aminosalicylic acid〔J〕.Scand J Gastroenterol，1998;33(2):174-9.

5 Dieleman LA，Palmen MJ，Akol H，et al.Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium(DSS)is characterized by Th1 and Th2 cytokines〔J〕.Clin Exp Immunol，1998;114(3):385-91.

6 陳建權，劉建平，郎曉猛，等.泄濁解毒方對潰瘍性結腸炎大鼠IL-10、TNF-α 及 NF-κB 表達的影響〔J〕. 中華中醫藥雜志，2010;25(3):423-5.

7 劉曉玲，王汝俊，李燕舞，等.康腸寧對DNCB誘導的大鼠實驗性潰瘍性結腸炎的治療作用〔J〕.中國新藥與臨床藥理，2010;21(3):248-50.

8 吳慧麗，李 慧.白芍總苷對潰瘍性結腸炎大鼠細胞因子影響的研究〔J〕.中南藥學，2010;8(2):128-31.

9 吳曉春，杜勝利，陳海生.蒲公英的研究與應用〔J〕.藥學實踐雜志，2002;4(20):247-8.