AM251對糖尿病腦病大鼠認知功能和海馬區細胞凋亡的影響

洪 艷 李 偉 趙 猛 (徐州醫學院，江蘇 徐州 22002)

糖尿病腦病是由于糖尿病糖代謝紊亂導致腦血管改變，損害了中樞神經系統，使大腦在結構、神經生理及神經精神等方面發生病理改變，以獲得性認知行為缺陷為特征的糖尿病慢性并發癥，是近幾年受到研究者重視的糖尿病慢性中樞神經系統并發癥，其機制可能為導致神經元興奮性的增加和抑制性的減少，造成神經元的興奮性毒作用〔1〕。海馬CA1區錐體細胞突觸膜上的AMPA受體介導中樞神經系統興奮性突觸傳遞，介導興奮性損傷〔2〕。本實驗通過選用CB1選擇性拮抗劑AM251對1型糖尿病腦病大鼠進行干預，該干預措施如果能使AMPA受體相關蛋白N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的融合蛋白(NSF)及凋亡相關蛋白caspase-3的表達水平下降，說明其對腦神經元的損害起到一定的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組、建模及干預方法 清潔級成年健康雄性SD大鼠30只(體重200～220 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供)。隨機分成3組:正常對照組10只(N組)，糖尿病組20只。糖尿病組通過腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)65 mg/kg建立1型糖尿病腦病模型。正常對照組用常規飼料喂養4 w，3 ml 0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液腹腔注射，再喂養12 w;模型組高脂高糖飼料喂養4 w，65 mg/kg STZ腹腔注射喂養4 w后測血糖，血糖＞16.7 mmol/L判斷為成模，以上大鼠均在相同環境下飼養，自由飲水、覓食。成模大鼠20只，隨機分成2組:糖尿病腦病組(D組)和AM251干預組(A組)各10只。成模8 w后A組給予AM251腹腔注射0.5 mg·kg-1·d-1，干預4 w。N組和糖尿病組同期給予等量Tris緩沖液(pH7.4)腹腔注射4 w。

1.2 主要試劑 STZ購自Sigma公司，AM251購自北京寶希迪科技有限公司，NSF抗體購自上海寶曼生物科技有限公司。

1.3 標本的采集和保存 喂養16 w以后，Y迷宮檢測學習記憶能力，在10%水合氯醛麻醉下，斷頭取腦，在冰上快速剝離出兩側海馬組織，一側置于1.5 ml EP管中置于-80℃冰箱凍存，用于Western印跡免疫印記實驗;一側用10%甲醛固定，用于免疫組織化學染色。

1.4 Y迷宮行為測試 Y-迷宮的控制儀有電壓控制按鈕、延時控制按鈕、自動控制按鈕和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、0四個按鈕，當分別按下I、Ⅱ、Ⅲ按鈕時，相應臂的信號燈亮，此時該臂不通電為安全區(紅燈區)，另外無燈光的兩臂及交界區均通電而成為非安全區(電擊區)。按下0按鈕，則三臂均不通電，但交界區通電。信號燈亮后，稍停片刻電柵才開始通電，這一短暫的間歇期由延時控制按鈕調節。將大鼠放入迷宮箱某一臂，適應環境2～3 min后通電電擊，致其一次性逃避至安全區為正確反應，否則為錯誤反應，先進行學習，學會后記錄其在30次電擊中的正確次數。

1.5 檢測細胞凋亡 將海馬組織用PBS洗3次后于4%的多聚甲醛中固定25 min，采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況。所用試劑盒為南京凱基生物有限公司提供。將用蛋白酶K消化后的切片用TUNEL液覆蓋，37℃下孵育90 min;SSC終止反應，抗HRP抗體常溫孵育15 min，PBS洗凈，DAB呈色。光鏡下凋亡細胞呈深淺不一的棕黃色。凋亡細胞半定量分析:根據凋亡細胞分布情況在400倍光鏡下，每組切片拍攝5個陽性視野，每個視野計數100個凋亡的細胞，以計算平均凋亡細胞數所占百分比作為凋亡指數。

1.6 Western印跡檢測NSF蛋白表達 新鮮海馬稱重后置于1.5 ml EP管中，加入勻漿液，于冰上充分勻漿，4℃、12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清，采用Folin測定總蛋白濃度后分裝，-80℃凍存備用。采用10% 的分離膠，5%的濃縮膠，上樣后80 V恒壓電泳約20 min溴酚藍至濃縮膠與分離膠交界處，換恒壓100V電泳2 h，使溴酚藍全部電泳出分離膠底部，裁膠，半干轉法將分離膠上的蛋白轉移到NC膜上，恒流80 mA，70 min后取出NC膜，放入封閉液中，搖床封閉1 h。然后加入抗NSF抗體染膜進行一抗孵育過夜(4℃)。再加入相應的熒光二抗，避光靜置1 h，Washing Buffer中避光搖床5 min×3次，計算機掃描紀錄結果。

1.7 免疫組織化學檢測NSF蛋白 石蠟包埋切片后先后放入二甲苯、乙醇Ⅰ、乙醇Ⅱ中進行脫蠟，雙蒸水沖洗浸泡5 min×2次，微波爐中進行抗原修復，冷卻后 PBS沖洗，3%H2O237℃ 10 min，雙蒸水沖洗5 min×3次，以消除內源性過氧化物酶活性，滴加試劑A，加入一抗4℃過夜，復溫后先后加入試劑B、C，PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗后蘇木素復染，不同濃度的乙醇脫水，加入二甲苯透明，最后封片，讀片。

2 結果

2.1 Y迷宮試驗結果 30次Y迷宮檢測實驗，1型糖尿病腦病大鼠的認知水平與N組相比明顯下降〔(11.24±1.41)次 vs(3.12±0.27)次，P＜0.05〕，但是當用 AM251治療后的大鼠(A組)與D組相比，認知水平有了很明顯的提高〔(8.38±0.85)次，P ＜0.05〕。

2.2 免疫組織化學法檢測NSF蛋白結果 海馬CA1區NSF含量在糖尿病腦病組較正常對照組明顯增加 (P＜0.05)，而AM251治療組與糖尿病腦病組比較，NSF表達減少(P＜0.05)。見圖1，圖2，表1。

表1 各組海馬神經元凋亡率及NSF蛋白表達比較(n=5，±s)

表1 各組海馬神經元凋亡率及NSF蛋白表達比較(n=5，±s)

與N組比較:1)P＜0.05;與D組比較:2)P＜0.05

組別 凋亡率(%) NSF蛋白(MOD)N組5.43±1.86 0.14±0.03 D組 48.61±7.361) 0.73±0.171)A組 23.34±6.222) 0.35±0.112)

3 討論

糖尿病腦病是指糖尿病引起的認知障礙和大腦的神經生理及結構改變，表現為學習、記憶、解決問題的能力下降〔3〕，1型糖尿病認知功能損害主要在聯想記憶和學習技能注意力方面〔4〕。糖尿病腦病的發病機制目前還沒有完全明確，但已發現糖尿病腦病與大腦缺血、氧化應激、非酶性蛋白糖基化、胰島素的副作用以及鈣離子穩態的改變等有關。糖尿病引起的腦缺血、缺氧可導致神經元興奮性的增加和抑制性的減少，造成神經元的興奮性毒作用被認為是糖尿病腦病病理機制之一，因此也被作為治療糖尿病腦病的關鍵靶點。NSF作為最有代表性的AMPA受體突觸體內調節蛋白，自Block等〔5〕于1988年首次純化出NSF以來，已被廣泛應用于研究中，近年來的研究發現NSF有很廣泛的組織分布特征，但優先表達在神經系統，而且在海馬最多，提示其神經生理功能〔6〕。由于CB1受體則主要位于腦、脊髓與外周神經系統中，與記憶、認知、運動控制的調節有關〔7〕，而CB受體I型抑制劑AM251直接作用于中樞神經系統，所以表現出的活性也是多樣的。國外報道多見于減肥、戒煙方面;國內報道主要關注改善記憶和認知障礙、治療精神疾病方面，因此本實驗使用AM251為干預措施，觀察其在糖尿病腦病的治療作用〔8〕。

本實驗表明長期糖尿病大鼠存在NSF表達增高，與海馬神經元凋亡增多有關，這可能是導致大鼠認知功能下降的原因;表明AM251可能通過降低NSF表達，改善糖尿病造成的海馬神經元凋亡，提高治療組大鼠認知能力。通過本實驗，我們發現在長期的糖尿病代謝紊亂可導致糖尿病大鼠NSF表達增多，海馬神經元凋亡增多，認知能力下降，可能參與糖尿病腦病的發生發展過程;而本實驗通過選用CB1選擇性拮抗劑AM251的干預，使大麻素受體中的1型受體(CB1)抑制從而下調NSF的表達，減少海馬神經元凋亡，改善其認知功能，從而發揮治療糖尿病腦病的作用。

1 孫海鷗，殷玉華，姬秋和.糖尿病腦病〔J〕.國外醫學·內分泌學分冊，2004;24(2):79-81.

2 Bredt DS，Nicoll RA.AMPA receptor trafficking at excitatory synapses〔J〕.Neuron，2003;40(2):361-79.

3 Alrarez EO，Beauquis J，Revsin Y，et al.Cognitive dysfunction and hippocampal changes in experimental type 1 diabetes〔J〕.Behav Brain Res，2009;198(1):224-30.

4 Strachan MW，Frier BM，Deary LJ.Type 2 diabetes and cognitive impairment〔J〕.Diabet Med，2003;20:1-2.

5 Block MR，Glick BS，Wilcox CA，et al.Purification of an N-ethylmaleimide sensitive protein catalyzing vascular transport〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1988;85(21):7852-6.

6 Puschel AW，Oconnor V，Betz H.The N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein(NSF)is preferentially expressed in the nervous system〔J〕.FEBS Lett，1994;347(1):55-8.

7 Pertwee RG.The pharmacology of cannabinoid receptors and their ligands:an overview〔J〕.Int J Obesity，2006;30(4):13-8.

8 Hou LC，Li N，Zheng LN，et al.CB1 cannabinoid receptor participates in the vascular hyporeactivity resulting from hemorrhagic shock in rats〔J〕.Chin Med J，2009;122(8):950-4.