黃芩莖葉總黃酮對大鼠心肌缺血再灌注細胞凋亡的保護作用及機制

于曉敏 郝祥俊 龔明玉 (承德醫學院，河北 承德 067000)

心肌缺血再灌注(IR)損傷后發生的嚴重心律失常是阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要原因，大大削弱了再通的意義〔1，2〕，其發生機制主要與再灌注后細胞內鈣超載、氧自由基大量生成、誘導心肌細胞凋亡等有關〔3〕。黃芩莖葉總黃酮(SSTF)為黃芩莖葉的提取物，其主要成分為黃酮類化合物，具有抗氧化及改善心腦血管的供血等廣泛的藥理活性〔4，5〕。但SSTF對缺血再灌注后心肌細胞的保護作用及機制，少有報道。本實驗建立大鼠心肌IR模型，旨在研究SSTF在損傷中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 SSTF純度為61.8%，是黃芩莖葉的提取物，其主要成分為黃酮類化合物，為唇形科植物。批號010608，由本院省重點實驗室-中藥研究所提供，用飽和NaHCO3溶解配制后灌胃。AnnexinⅤ-EGFP凋亡試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)。STAT1，STAT3兔抗鼠多克隆抗體(美國Santa公司)。

1.1.2 動物 健康SD大鼠40只，體重(220±20)g，雌雄各半。購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司，許可證號scxk津2009-001。

1.1.3 主要儀器 DB-3型心電圖機，上海光電醫用電子儀器有限公司:DW-2000型動物人工呼吸機，上海嘉鵬科技有限公司:FACSCalibur流式細胞儀，美國B＆D公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組及處理 40只SD大鼠隨機分為5組:假手術組(sham組)、缺血再灌注組(IR組)、SSTFⅠ組 、SSTFⅡ組、SSTFⅢ組，每組8只。4組大鼠均制備心肌IR模型，其中3個SSTF組大鼠于手術前1 w分別灌服不同劑量的SSTF(17.5、35、70 mg·kg-1·d-1)，連用 7 d;sham 組和 IR 組術前分別給予相應容積的生理鹽水，時間同SSTF組。

1.2.2 心肌缺血再灌注模型的制備 10%烏拉坦腹腔注射麻醉(1 ml/100 g)大鼠，仰臥位固定，用針型電極插入大鼠四肢皮下記錄標準肢體Ⅱ導聯心電圖。于胸骨左緣3～4肋間切開胸壁，暴露心臟，在左心耳與肺動脈干之間結扎左冠狀動脈前降支，同時在結扎線與血管之間穿一直徑2 mm，長5 mm的硅膠管，結扎30 min;然后剪斷縫合線，取出硅膠管，再灌注2 h，假手術組僅分離前降支，但不結扎。

1.2.3 Annexinv/PI雙染，流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡情況 再灌注后取梗死區邊緣心肌組織5 mm3，機械法制備單細胞懸液，經200目尼龍網過濾。取1 ml細胞，1 500 r/min 4℃離心5min，收集細胞。加入1 ml冷的PBS洗滌細胞兩次。將細胞重懸于500 μl上樣緩沖液，加入5 μl Annexin V-EGFP和5 μl PI，輕輕混勻，室溫避光反應15 min，上機檢測，計算凋亡心肌細胞百分比。結果判定:AnnexinⅤ-/PI-為正常細胞，AnnexinⅤ+/PI-為凋亡細胞，AnnexinⅤ +/PI+為壞死細胞。

1.2.3 SP免疫組化檢測STAT1及STAT3蛋白的表達 取大鼠心肌組織，置于10%中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，連續切片，將切片用3%H2O2室溫孵育10 min消除內源性過氧化氫酶的活性，PBS洗5 min×3;置于0.01%枸櫞酸鹽緩沖液中，微波爐抗原修復;PBS洗5 min×3，滴加非免疫血清封閉液，室溫孵育20 min;傾去血清后分別滴加STAT1(1∶200)及STAT3(1∶100)的一抗，于4℃下過夜;PBS洗5 min×3，滴加生物素標記二抗，室溫下1 h;PBS洗5 min×3，滴加HRP-SA，于室溫下放置1 h;PBS洗5 min×3，滴加DAB進行顯色;蘇木素復染細胞核，脫水、透明、封片。常規設立陰性對照。結果判定:陽性信號呈棕黃色顆粒，STAT1及STAT3蛋白表達于胞漿和胞核。定量分析:在光學顯微鏡400倍視野下，每張切片隨機選取陽性細胞分布均勻的5個視野，計數著色細胞占視野細胞總數的百分數，取平均值。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測Annexinv-EGFP標記的心肌細胞凋亡情況 與sham組相比，IR組細胞凋亡率明顯增加(12.45%±2.17%vs 6.78% ±0.96%，P＜0.01);與 IR組相比，Ⅰ、Ⅱ、ⅢSSTF組細胞凋亡率均明顯降低(10.32% ±2.04%，9.44% ±1.85%，7.96% ±1.23%，P＜0.05，P＜0.01)，提示 SSTF可減輕缺血再灌注誘導的大鼠心肌細胞凋亡。

2.2 SP免疫組化檢測STAT1及STAT3蛋白的表達情況 與sham組比較，IR組STAT1蛋白表達陽性細胞率明顯升高(P＜0.01)，但STAT3蛋白表達陽性細胞率明顯降低(P＜0.01);與IR組相比，SSTFⅡ組和SSTFⅢ組STAT1蛋白表達陽性細胞率明顯降低(P＜0.05，P＜0.01);但SSTFⅠ組、SSTFⅡ組和SSTFⅢ組STAT3蛋白表達陽性細胞率明顯升高(P＜0.05，P＜0.01)，說明IR增加STAT1蛋白表達，減少STAT3蛋白表達;SSTF下調STAT1蛋白表達，上調STAT3蛋白表達。見表2及圖 1，圖 2。

表2 SSTF對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡相關基因JAK2蛋白表達的影響(n=8，±s)

表2 SSTF對大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡相關基因JAK2蛋白表達的影響(n=8，±s)

與sham組比較:1)P＜0.01;與IR組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 濃度(mg·kg-1·d-1)STAT1陽性細胞率 STAT3陽性細胞率sham - 0.084±0.05 0.276±0.09 IR - 0.257±0.09 0.074±0.04 SSTFⅠ 17.5 0.211±0.07 0.185±0.062)SSTFⅡ 35 0.168±0.042) 0.193±0.082)SSTFⅢ 70 0.117±0.063) 0.237±0.101)

3 討論

近年來，心血管疾病已經成為危害人類健康的主要殺手，而很多因素造成了心肌和血管的損害〔6〕。IR可加重心肌損傷，是心臟手術，體外循環常見的一種病理生理變化，可造成多種不良的臨床后果，如心肌梗死、心力衰竭等。心肌細胞死亡的形式有壞死和凋亡兩種，近期研究認為細胞凋亡是心肌IR損傷的特征之一〔7～9〕，抑制IR所引起的心肌細胞凋亡有助于減小心肌梗死面積，改善心功能〔10〕。細胞凋亡是生物體生命過程中不可缺少的組成部分，貫穿于整個生命活動中。

本實驗證明IR可引起細胞凋亡，而SSTF可抑制IR引起的細胞凋亡而發揮心肌保護作用。

近年來研究發現，JAK/STAT信號通路與心臟疾病發生的相關病理機制關系密切，其涉及心肌細胞的生長、存活和凋亡，在心臟疾病的發病機制中發揮重要作用〔11〕。JAK/STAT信號通路與缺血再灌注損傷有一定關系。在哺乳動物JAKs家族中已發現4種激酶，即 JAK1、JAK2、JAK3和 Tyk2。STATs作為JAKs的靶蛋白，是存在于胞質中的一個轉錄因子家族，有7種STAT 蛋白，即 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。STAT1和STAT3與細胞凋亡密切相關，STAT1是細胞凋亡促進因子，STAT3是細胞凋亡抑制因子。本實驗說明IR增加STAT1蛋白表達，減少STAT3蛋白表達;SSTF下調STAT1蛋白表達，上調STAT3蛋白表達。

綜上所述，SSTF可直接作用于心肌細胞，減輕心肌IR損傷，且其心肌保護效應在一定劑量范圍內隨劑量增加而增加，其保護機制可能通過下調STAT1蛋白表達，上調STAT3蛋白表達，進而抑制細胞凋亡實現的。

1 Kucharczak J，Simmons MJ，Fan Y，et al.To be，or not to be:NF-ΚappaB is the answer-role of Rel/NF-kappaB in the regulation of apoptosis〔J〕.Oncogene，2007;22(56):8961-82.

2 Gourine AV，Molosh AI，Poputnikov D，et al.Endothelin-1 exerts a pre-conditioning-like cardioprotective effect against ischemia/reperfusion injury via the ET(A)receptor and the mitochondrial K(ATP)channel in the rat in vivo〔J〕.Br J Pharmacol，2005;144(3):331-7.

3 Dai W，Kloner RA.Potential role of renin-angiotensin system blockade for preventing myocardial ischemia/reperfusion injury and remodeling after myocardial infarction〔J〕.Postgrad Med，2011;123(2):49-55.

4 趙淑敏，楊宏光，孔祥玉，等.黃芩莖葉總黃酮預處理對缺血再灌注心肌超氧化物歧化酶和丙二醛含量的影響〔J〕.中國臨床康復，2006;31(10):52-4.

5 張 力，龔明玉，張泓波，等.黃芩莖葉總黃酮預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.哈爾濱醫科大學學報，2007;41(5):437-40.

6 Oldgren J，Wallentin L，Grip L，et al.Myocardial damage，inflammation and thrombin inhibition in unstable coronary artery disease〔J〕.Eur Heart J，2003;24(1):86-93.

7 Li Y，Ge X，Liu X.The cardioprotective effect of postconditioning is mediated by ARC through inhibiting mitochondrial apoptotic pathway〔J〕.Apoptosis，2009;14(2)164-72.

8 Bhuiyan MS，Fukunaga K.Activation of HtrA2，a mitochondrial serine protease mediates apoptosis current knowledge on HrtA2 mediated myocardial ischemia/reperfusion injury〔J〕.Cardiovasc Ther，2008;26(3):224-32.

9 Scarabelli TM，Gottlieb RA.Functional and clinical repercussions of myocyte apoptosis in the multifaceted damage by ischemia/referfusion injury:old and new concepts after 10 years of contributions〔J〕.Cell Death Differ，2004;11(Suppl 2):S144-52.

10 Zhao ZQ，Morris CD，Budde JM，et al.Inhibition of myocardial apoptosis reduces infarct size and improves regional contractile dysfunction during reperfusion〔J〕.Cardiovasc Res，2003;59(1):132-42.

11 黃培元，李新明.JAK-STAT信號通路與心臟疾病研究進展〔J〕.中國現代藥物應用，2010;4(22):246-7.