銀杏內酯B對老齡大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷炎癥反應的作用

劉 暉 張嘉偉 林 宇 王秀清 趙旭偉 (齊齊哈爾醫學院第一附屬醫院，黑龍江 齊齊哈爾 161042)

研究表明腦缺血-再灌注損傷可引起嚴重的神經功能障礙，而銀杏葉提取物主要活性成分銀杏內酯B對腦缺血/再灌注后腦組織具有保護作用〔1〕。尼莫地平對腦缺血-再灌注腦損傷有明確的保護作用〔2，3〕。本實驗觀察銀杏內酯B對腦損傷腦組織含水量及炎癥因子和相關細胞黏附分子表達水平的影響，探討其治療缺血性腦血管病炎癥修復的效果。

1 材料和方法

1.1 動物 60只SD老齡大鼠，雌雄各半，體重400～650g，鼠齡20～22月齡。隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平(4 mg/kg)組和銀杏內酯 B(2.5、5.0、10mg/kg)治療組，每組10只。

1.2 藥物與試劑 水合氯醛(中國醫藥上海化學試劑公司);尼莫地平注射液(北京雙鶴藥業股份有限公司，批號:120731);銀杏內酯B(南京澤朗醫藥科技有限公司，批號:101201);其他試劑為國產分析純。

細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)試劑盒(美國TBI公司，批號:20110501);白介素(IL)-6、IL-1β放免試劑盒(上海海軍醫學工程研究所，批號:20121006);TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物公司，批號:20110906)。

1.3 實驗方法 假手術組和模型組只注射等體積的生理鹽水，尼莫地平和銀杏內酯B組分別注射相應劑量的藥物，各組動物舌下靜脈注射給藥，1次/d，連續3 d，最后一次給藥1 h后，采用Longa法制作老齡大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型〔4〕。老齡大鼠腹腔注射乙醚麻醉后固定于手術臺，行頸部正中縱行切口，行氣管插管，小心分離雙側頸總動脈，避免傷及迷走神經，用無創動脈夾夾閉雙側動脈和基底動脈30 min，然后松開動脈夾使血流再通，即復制出腦缺血再灌注模型。假手術組僅分離雙側頸總動脈，不夾閉。無菌縫合后回籠飼養。

1.4 測定項目 干濕法測定腦組織含水量:處死老齡大鼠，快速斷頭取腦。將大腦半球用濾紙吸去表面殘血，稱濕重后置105℃烘箱烤干至恒重，再秤干重，計算腦組織含水量。腦組織含水量(%)=(腦組織濕重-腦組織干重)/腦組織濕重×100%〔5〕。

缺血再灌注72 h后斷頭取腦。用冷PBS沖洗3次，濾紙吸干，用冷的生理鹽水配成10%腦組織勻漿，勻漿液4℃最大速度離心10 min，取上清液，用ELISA試劑盒分別測定腦組織中ICAM-1、E-selectin和TNF-α的表達水平。

血清IL-6、IL-1β含量測定:缺血再灌注72 h后，取靜脈血3 ml，3 000 r/min離心5 min后取上清，按照RIA試劑盒說明進行測定。

2 結果

2.1 銀杏內酯B對老齡大鼠腦組織含水量的影響 腦缺血再灌注后，模型組老齡大鼠的腦組織含水量顯著高于假手術組(P＜0.01)，經過陽性對照藥物尼莫地平處理后腦組織含水量顯著降低(P＜0.01)，銀杏內酯B各劑量組可降低缺血再灌注后老齡大鼠的腦組織含水量，且具有濃度依賴性，含水量隨給藥濃度的升高呈降低趨勢(P＜0.01或P＜0.05)，最高劑量組(10.0 mg/kg)含水量的降低程度最顯著，較尼莫地平組降低腦水腫能力更顯著。見表1。

2.2 銀杏內酯B對腦缺血再灌注老齡大鼠腦組織ICAM-1和E-selectin表達水平的影響 與假手術組比較，模型組ICAM-1和E-selectin的表達水平顯著升高(P＜0.01);銀杏內酯B組和尼莫地平組ICAM-1和E-selectin的表達水平均不同程度降低(P＜0.01或P＜0.05)，且呈明顯劑量-效應依賴關系。見表1。

2.3 銀杏內酯B對腦缺血再灌注老齡大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響 與假手術組比較，模型組 IL-6、IL-1β和TNF-α的含量顯著升高(P＜0.01);銀杏內酯B組和尼莫地平組IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均不同程度降低(P＜0.01或P＜0.05)，且呈明顯劑量-效應依賴關系。見表1。

表2 銀杏內酯B對腦缺血再灌注老齡大鼠腦組織含水量、ICAM-1、E-selectin表達水平及血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響(±s，n=10)

表2 銀杏內酯B對腦缺血再灌注老齡大鼠腦組織含水量、ICAM-1、E-selectin表達水平及血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影響(±s，n=10)

與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組別 劑量(mg/kg)腦組織含水量(%)ICAM-1(ng/ml)E-selectin/(ng/ml) IL-6/(ng/L) IL-1β/(ng/L) TNF-α(mg/g)假手術組 - 75.84±1.162) 0.86±0.192) 12.49±3.172) 97.12±16.712) 137.48±21.492) 0.41±0.072)模型組 - 85.12±2.31 1.49±0.53 20.67±6.37 197.18±21.58 287.27±31.29 1.49±0.71尼莫地平組 4.0 79.18±1.492) 0.97±0.372) 10.19±5.072) 124±16.492) 149.17±19.782) 0.57±0.462)銀杏內酯B 2.5 81.21±2.181) 1.29±0.371) 14.34±4.971) 179.25±12.491) 197.28±14.191) 1.07±0.621)銀杏內酯B 5.0 80.12±1.461) 1.28±0.441) 12.04±3.711) 159.28±12.791) 164.47±13.291) 0.72±0.241)銀杏內酯B 10.0 78.94±1.212) 1.01±0.232) 10.18±2.492) 132.19±21.482) 148.19±20.072) 0.61±0.492)

3 討論

腦缺血-再灌注損傷引起的腦血管病是臨床常見的致死性疾病之一，尤其對高齡患者而言，危害極大，致死率、致殘率極高〔6，7〕。腦缺血-再灌注過程作用機制復雜，主要通過興奮性氨基酸、氧自由基、細胞因子等刺激與炎癥有關的細胞因子表達，包括 TNF-α、IL-6、IL-1β、E-selectin、ICAM-1 等，從而促進中性粒細胞黏附及遷移，導致炎癥反應。但是過度的炎癥反應不僅影響局部的血液供應，而且可以直接破壞組織結構，加重腦損害及腦水腫癥狀，從而造成腦組織損傷。

本實驗中給老齡大鼠構建腦缺血-再灌注模型后，缺血區腦組織發生明顯壞死，模型組動物腦組織含水量顯著增高，預示腦水腫的發生，同時組織中E-selectin、ICAM-1的表達水平和血清中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量顯著增高;通過預先給予不同劑量的銀杏內酯B處理3 d，能顯著減輕腦水腫癥狀，減少腦缺血-再灌注后炎癥介質的釋放，表明銀杏內酯B在減輕腦缺血組織的炎癥反應上具有顯著效果，其效果與尼莫地平具有比較性，可以說明其是治療腦血管疾病、減輕缺血性腦損傷炎癥反應的潛在藥物〔8，9〕，但其作用機制，還需要進一步研究。

1 Gu JH，Ge JB，Li M，et al.Inhibition of NF-kappa B activation is associated with anti-inflammatory and anti-apoptotic effects of Ginkgolide B in a mouse model of cerebral ischemia/reperfusion injury〔J〕.Eur J Pharm Sci，2012;47(4):652-60.

2 趙士弟，黃 麗，姜之全，等.金雀異黃酮預適應對大鼠小腦浦肯野細胞缺血再灌注損傷的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2012;32(13):2758-60.

3 樂樂樂，董 志.利莫那班對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠的保護作用〔J〕.中國老年學雜志，2011;31(12):2226-8.

4 Huang MH，Qian YS，Guan T，et al.Different neuroprotective responses of Ginkgolide B and bilobalide，the two Ginkgo components，in ischemic rats with hyperglycemia〔J〕.Eur J Pharmacol，2012;677(1-3):71-6.

5 Ma SW，Yin HF，Chen LY，et al.Neuroprotective effect of ginkgolide K against acute ischemic stroke on middle cerebral ischemia occlusion in rats〔J〕.J Nat Med-Tokyo，2012;66(1):25-31.

6 Yang ZZ，Li J，Li SX，et al.Effect of ginkgolide B on striatal extracellular amino acids in middle cerebral artery occluded rats〔J〕.J Ethnopharmacol，2011;136(1):117-22.

7 Fang WR，Deng Y，Li YM，et al.Blood brain barrier permeability and therapeutic time window of Ginkgolide B in ischemia-reperfusion injury〔J〕.Eur J Pharm Sci，2010;39(1-3):8-14.

8 Wang JT，Jiang SY，Kwong JMK，et al.Nuclear factor-kappa B p65 and upregulation of interleukin-6 in retinal ischemia/reperfusion injury in rats〔J〕.Brain Res，2006;1081:211-8.

9 金 晶，董宇翔，李 戈.銀杏葉提取物在老年性疾病治療中的應用進展〔J〕.中國老年學雜志，2007;27(6):596-8.