羅格列酮對高脂飲食大鼠胰腺核因子-κB表達和β細胞凋亡的影響

郝欣欣 馬博清 王 敬 宋光耀 高 哲 陳金虎 劉 晶

(河北省人民醫院內分泌科，河北 石家莊 050051)

胰島素抵抗是2型糖尿病重要發病機制之一，大鼠高脂飲食誘導的胰島素抵抗模型與人類肥胖時的胰島素抵抗、糖耐量異常相似。流行病學研究證實，糖尿病患者體內存在慢性低度炎癥反應。轉錄因子核因子(NF-κB)是炎癥信號通路的關鍵因子，游離脂肪酸、白介素-1β(IL-1β)等炎癥因子可啟動轉錄因子NF-κB。NF-κB可能與胰島素抵抗及2型糖尿病發病有關。羅格列酮是噻唑烷二酮類藥物，是選擇性過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑(PPAR-γ)。本研究旨在觀察高脂飲食大鼠胰腺組織NF-κB表達情況，并探索羅格列酮對胰島素抵抗的改善作用和抗凋亡作用及可能機制。

1 資料與方法

1.1 資料 清潔級健康雄性Wistar大鼠(體重290～320 g)40只，河北醫科大學實驗動物中心提供。馬來酸羅格列酮，葛蘭素史克天津有限公司，4 mg/片，批號:05060018。

1.2 方法

1.2.1 動物分組情況 隨機分為正常對照組(NC組)16只，高脂組(HF組)24只。NC組給予基礎飼料(碳水化合物占65.5%，脂肪占10.3%，蛋白質占24.2%);HF組喂以高脂飼料(脂肪59.8%，碳水化合物20.1%，蛋白質20.1%)。4 w后兩組各隨機選8只大鼠行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗。HF組剩余16只大鼠隨機分為HF對照組和RSG組，每組8只。RSG組灌胃馬來酸羅格列酮蒸餾水混懸液3 mg·kg-1·d-1。

1.2.2 大鼠胰島素抵抗評估及動物標本取得 用高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗測定穩態葡萄糖輸注率來評估胰島素抵抗程度，3%戊巴比妥40 mg/kg麻醉大鼠，行右側頸動脈及頸靜脈插管，繼續單籠喂養，第3天禁食10 h，行清醒狀態下高胰島素-正葡萄糖鉗夾實驗，頸靜脈導管連接雙通道微量輸液泵，分別緩慢輸注胰島素和葡萄糖，血糖穩定后以4 mU·kg-1·min-1的速率持續輸注胰島素，每10分鐘測血糖一次，根據血糖值調整葡萄糖輸注速度，使大鼠血糖保持在(5±0.5)mmol/L的范圍至少30 min為達到穩態。記錄穩態下GIR平均值為胰島素敏感性指標。鉗夾完畢大鼠留取血標本，頸動脈放血處死，仰臥位固定于手術臺，打開腹腔，取胰腺，放入液氮，-80℃冰箱保存。

1.2.3 血液學指標測定 空腹胰島素(FINS)測定用放射免疫法;鼠尾靜脈空腹血糖(FPG)測定采用Roche公司羅康全快速血糖儀;血脂測定采用酶法，美國產Beckman X20自動生化分析儀;血清游離脂肪酸(FFA)采用銅顯色法測定。

1.2.4 Western印跡測胰腺組織NF-κB 從-80℃冰箱取胰腺組織，按凱基核蛋白及胞漿蛋白提取試劑盒裂解提取核蛋白，以考馬斯亮藍法用紫外分光光度計測蛋白濃度，分裝-20℃保存。將提取的組織蛋白溶液與5×上樣緩沖液按照4∶1的比例混勻，煮沸5 min使蛋白變性。分別配制10%分離膠和5%濃縮膠。灌膠于1.5 mm厚的電泳板內。每孔50 μg蛋白上樣，電泳。濕轉法將膠轉移至PVDF膜;5%脫脂奶粉封閉1 h;三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TTBS)漂洗10 min×3，兔抗NF-κB p65多克隆抗體由Santa公司提供，以TTBS 1∶200稀釋后封閉，4℃ 5 h，取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，辣根酶標記山羊抗兔 IgG TTBS 1∶1 000稀釋后封閉，常溫 1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，DAB顯色后數碼相機照相。

1.2.5 TUNTL法測胰島組織凋亡 采用TUNEL技術檢測胰島細胞凋亡率。TUNEL試劑盒由德國寶靈曼公司提供。由兩位病理醫師分別閱片，凋亡細胞核染深棕色。將細胞核染為深棕色的細胞定為凋亡的胰島β細胞，每個胰島的細胞凋亡率(%)=β細胞凋亡數/β細胞總數×100%。每組大鼠取4張胰腺切片，每張切片中計數4個胰島。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5 for Windows統計軟件，數據用±s表示，行正態性檢驗及方差齊性檢驗。兩個樣本均數比較采用t檢驗，多個樣本均數比較行完全隨機設計單因素方差分析，組間差異顯著時進行兩兩比較q檢驗。

2 結果

2.1 各組生化指標及GIR變化 見表1、表2。與NC組相比HF組第4周出現血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、FFA、FPG、FINS升高(P＜0.05)，GIR下降(P＜0.05)。試驗第8周HF組與 NC組相比 TC、TG、FFA、FPG、FINS繼續升高(P＜0.05)，GIR下降(P ＜0.05)，RSG組與HF組相比TC、TG、FFA、FPG、FINS下降(P＜0.05)，GIR升高(P＜0.05)，RSG 組和 NC組之間 TC、TG、FFA、FPG、FINS及 GIR 無差別。

2.2 胰腺NF-κB表達 見圖1。Western印跡測得，HF組胰腺組織蛋白NF-κB含量較NC組升高，RSG組 NF-κB表達較HF組降低，NC組與RSG組之間無差異。

2.3 胰島β細胞凋亡情況 見圖2。HF組大鼠胰島β細胞凋亡數目較NC組增多，RGS組大鼠胰島β細胞凋亡數目較HF組降低，NC組與RSG組相比無明顯差異。

表1 第4周NC組和HF組TG、TC、FFA、FPG、FINS、GIR的比較(n=8，±s)

表1 第4周NC組和HF組TG、TC、FFA、FPG、FINS、GIR的比較(n=8，±s)

與NC組比較:1)P＜0.05

組別 TG(mmol/L) TC(mmol/L) FFA(mmol/L) FPG(mmol/L) FINS(mIU/L) GIR(mg·kg-1·min-1 NC組 0.78±0.11 0.59±0.10 0.56±0.21 4.47±0.36 12.87±5.19 28.50±5.21 HF組 0.92±0.101) 0.74±0.091) 1.29±0.31) 5.22±0.281) 19.67±3.961) 20.32±2.991))

表2 第8周NC組、HF組、RSG組TG、TC、FFA、FPG、FINS、GIR的比較(n=8，±s)

表2 第8周NC組、HF組、RSG組TG、TC、FFA、FPG、FINS、GIR的比較(n=8，±s)

與NC組比較:1)P＜0.05;與HF組比較:2)P＜0.05

組別 TG(mmol/L) TC(mmol/L) FFA(mmol/L) FPG(mmol/L) FINS(mIU/L) GIR(mg·kg-1·min-1 4.36±4.71 29.06±4.99 HF 1.05±0.051) 0.77±0.061) 1.45±0.261) 5.53±0.421) 25.84±11.21) 18.54±3.891)RSG 0.79±0.062) 0.60±0.072) 1.09±0.262) 4.81±0.392) 13.56±2.092) 24.75±1.541)2))NC 0.83±0.05 0.55±0.10 0.70±0.31 4.52±0.42 1

圖1 第8周大鼠胰腺組織NF-κB表達

圖2 第8周胰島凋亡情況(×200)

3 討論

胰島素抵抗是指胰島素靶組織對胰島素敏感性和反應性下降，從而導致正常劑量的胰島素與特異性受體結合以后產生低于正常生物學效應的一種狀態。高脂飲食誘導胰島素抵抗模型與人類肥胖時的胰島素抵抗、糖耐量異常相似，尚具有可靠性高、簡便、易行、價格相對較低等優點。高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術由De Fronzo 1979年創立，是目前世界上公認的測定機體胰島素抵抗的金標準。它以同時輸入外源胰島素及葡萄糖的方法避免了內源性胰島素缺乏(如糖尿病病人)及低血糖(如胰島素耐量試驗)對胰島素敏感性測定的影響，本文采用清醒狀態的鉗夾術，測定胰島素敏感性更接近于生理狀態〔1〕。

炎癥和2型糖尿病、胰島素抵抗有非常密切的關系。2型糖尿病患者有明顯的白細胞增加，在肥胖或2型糖尿病患者血漿中免疫球蛋白、TNF-α、IL-6等明顯增高。轉錄因子NF-κB是由多肽鏈p65和p50蛋白亞基構成的二聚體。當細胞處于靜息狀態時，NF-κB 位于細胞質中，NF-κB 與 NF-κB 抑制蛋白(IκB)形成三聚體以失活狀態存在于細胞質中。外界信號通過不同途徑激活IκB激酶，即Iκk復合體，NF-κB得以激活，并移位進入細胞核，與DNA鏈上特異部位結合，啟動基因轉錄，發揮調控細胞功能的作用。Apiradee 等〔2〕研究表明，IκB/NF-κB 炎癥通路活化是骨骼肌胰島素抵抗的機制，他們發現，IκBβ蛋白表達與鉗夾試驗的葡萄糖輸注率正相關，提示IκB/NF-κB炎癥通路與胰島素抵抗正相關。

本研究中，4 w的高脂喂養大鼠在高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗中GIR較正常喂養大鼠降低，表明高脂誘導胰島素抵抗大鼠模型造模成功。FFA、TC、TG的升高支持了高脂喂養的作用，FPG升高、FINS升高與人類糖耐量減低及高胰島素血癥相似。8 w的高脂喂養大鼠蛋白印記證實胰腺組織NF-κB蛋白表達增加，說明高脂誘導的胰島素抵抗大鼠體內包括分泌胰島素的胰腺在內已存在低度慢性炎癥反應，可能機制為高脂引起的NF-κB通路活化，激活了炎癥網絡。羅格列酮是近年來應用的一種胰島素增敏劑，是核轉錄因子過氧化酶體增殖物激活受體γ的配體，可提高肝臟、骨骼肌和脂肪等靶組織對胰島素的敏感性。本研究中羅格列酮可以降低高脂喂養大鼠的胰島素抵抗程度，其機制可能是通過阻斷NF-κB的激活來達到治療炎癥、改善胰島素抵抗的目的。臨床上常用的糖皮質激素、阿司匹林及水楊酸鹽等均為NF-κB抑制劑。

凋亡不僅是1型糖尿病也是2型糖尿病胰島β細胞死亡的主要形式，由誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)催化產生的一氧化氮(NO)是細胞因子介導的β細胞損害及功能異常的潛在介質。Holohan等〔3〕研究表明，誘導型一氧化氮合成酶催化產生的一氧化氮與 IL-1β和干擾素-γ表達相關，IL-1β和干擾素-γ介導的一氧化氮生成是β細胞凋亡的充分必要條件。本研究中，高脂喂養大鼠8 w胰島β細胞凋亡率升高，即在胰島素抵抗階段出現了胰島β細胞功能障礙，可能機制為一方面游離脂肪酸的脂毒性作用;另一方面，炎癥過程的關鍵核因子NF-κB的活化，啟動了炎癥網絡，損傷了胰島β細胞。羅格列酮干預可改善胰島β細胞凋亡水平，表明羅格列酮也具有改善β細胞功能的作用。

1 Kraegen EW，James DE，Bennet SP，et al.In vivo insulin sensitivity in the rat determined by euglycemic clamp〔J〕.Am J Physiol，1983;245:E1.

2 Apiradee Sriwijitkamol，Christine Christ-Roberts，Rachele Berria，et al.Reduced skeletal muscle inhibitor of κB β content is associated with insulin resistance in subjects with type 2 diabetes reversal by exercise training〔J〕.Diabetes，2006;55(3):760-7.

3 Holohan C，Szegezdi E，Ritter T，et al.Cytokine-induced beta-cell apoptosis is NO-dependent，mitochondria-mediated and inhibited by BCL-XL〔J〕.J Cell Mol Med，2008;12(2):591-606.