銅綠假單胞菌金屬β-內酰胺酶及耐藥性的研究

畢愛芬

近幾年，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥逐年上升，給治療帶來巨大挑戰[1]。由于銅綠假單胞菌產生金屬β-內酰胺酶，而使得其對碳青霉烯類抗生素產生嚴重的耐藥性，金屬β-內酰胺酶可水解基本所有的β-內酰胺酶類抗生素，加之其耐藥基因編碼區在整合子內，使得耐藥性能在菌株之間廣泛傳播[2]，而IMP與VIM是最常見的金屬β-內酰胺酶的耐藥基因，但金屬β-內酰胺酶的攜帶率每個地區差異很大，因此，本研究收集本院2010-2012年的銅綠假單胞菌，并進行金屬β-內酰胺酶與耐藥基因檢測，了解目前金屬β-內酰胺酶的相關耐藥以及在銅綠假單胞菌的攜帶率，以便為臨床治療提供有效的指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實驗菌株由廣州市花都區中西醫結合醫院2009年10月-2012年6月住院及門診患者標本中分離的銅綠假單胞菌共216株。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 27853與大腸埃希菌ATCC 25922，購自衛生部臨床檢驗中心。

1.1.2 儀器與試劑 儀器為法國生物梅里埃公司的VITEK32全自動微生物鑒定及藥敏系統，M-H瓊脂為廣州環凱生物有限公司，亞胺培南（IPM，10 μg/片）、頭孢他啶（CAZ，30 μg/片）均購自英國OXl0D公司，EDTA（100raM，10 ul/片），PCR MIX來自廣州東盛生物科技有限公司。引物由上海英駿生物有限公司合成。

1.1.3 引物序列見表1。

引物 序列 PCR產物大小 參考文獻VIM-F GTTTGGTCGCATATCGCAAC 645bp [3]VIM-R CTACTCGGCGACTGAGCGAT IMP-F CGGCCKCAGGAGMGKCTTT 587bp [4]IMP-R AACCAGTTTTGCYTTACYAT Int1-F GGTGTGGCGGGCTTCGTG 457bp [5]Int1-R GCATCCTCGGTTTTCTGG SPM-F GCGTTTTGTTTGTTGCTC 786 bp [3]SPM-R TTGGGGATGTGAGACTAC GIM- F AGAACCTTGACCGAACGCAG 746 bp [3]GIM-R ACTCATGACTCCTCACGAGG

1.2 方法

1.2.1 金屬β-內酰胺酶檢測 采用雙紙片協同法檢測金屬β-內酰胺酶，按照紙片擴散法標準操作[6]，以0.5麥氏調整菌液濃度后，接種于M-H瓊脂平板上，貼上兩張空白紙片，兩者距離大于20 mm，分別加上3 μl的2-巰基乙醇原液與5 μl的EDTA（100 mmol/L），然后在距離20 mm處貼上亞胺培南（10 mg），頭孢他啶（10 mg），經過夜35 ℃培養，若空白紙片與任何一個藥敏紙片的抑菌環有擴大者，則顯示該菌株產金屬酶。

1.2.2 整合子檢測 采用煮沸法提取細菌DNA[7]。在培養基上挑取2～3個菌落于400 μl的TE緩沖液里混勻，然后95 ℃10 min水浴，12 000 r/min離心10 min，取上清液作PCR模板，-20 ℃保存備用。按照產品說明配制PCR體系，PCR循環參數為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，循環30次；72 ℃ 5 min。取PCR產物電泳后，經凝膠成像系統分析。

1.2.3 耐藥基因檢測 細菌質粒DNA的提取采用SDS堿裂解法，按照產品說明配制PCR體系，PCR循環參數為：95 ℃4min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 循環 30 次；72 ℃8 min。

1.2.4 質控 每周按標準嚴格使用 質 控 菌銅綠假單胞菌ATCC 27853與大腸埃希菌ATCC 25922對實驗進行質量控制。

2 結果

2.1 菌株基本情況 攜帶金屬β-內酰胺酶的菌株共檢測出80株，占37.03%（80/216），來源科室主要是ICU、內科及外科，分別是33例（41.25%），18例（22.5%），14例（17.5%），標本大部分來自患者痰，占61.25%（49/80），患者男54例，女26例，平均年齡77歲。

2.2 產金屬β-內酰胺酶菌株 216株臨床分離株通過雙紙片協同法檢出80株產金屬β-內酰胺酶（MBL），其中78.75%（63/80）的MBL菌株都是多藥耐藥菌株，甚至有18.75%（15/80）是泛耐藥株。藥敏試驗結果中，耐藥性最高的前三位是氨曲南，環丙沙星和哌拉西林，耐藥率都達77%以上，見表2。

表2 80株產金屬β-內酰胺酶的銅綠假單胞菌耐藥情況

2.3 VIM與IMP基因檢測結果 對80株MBL菌株進行IMP與VIM基因擴增，結果發現23株（28.75）攜帶IMP基因，9株（11.25%）被檢測到有攜帶VIM基因，它們的長度分別是587bp與645bp。見圖1、圖2。其中9株攜帶VIM基因的菌株都對亞胺培南抗生素耐藥，而87.5%的VIM與IMP基因陽性菌株都是多藥耐藥。

2.4 整合子檢測結果 Ⅰ類整合子檢出率卻達MBL陽性菌株的82.5%（66/80），電泳圖可見457bp大小目的片段，見圖3。其中亞胺培南耐藥菌株中Ⅰ類整合子陽性率占85.71%（48/56）。未檢出SPM與GIM基因。

圖1 IMP基因電泳圖

圖2 VIM基因電泳圖

圖3 Int1基因電泳圖

3 討論

近幾年，產金屬酶的銅綠假單胞菌備受臨床關注，正由于金屬酶能水解幾乎所有的β-內酰胺酶類抗生素，甚至出現了超級細菌攜帶NDM-1基因金屬酶，給臨床治療帶來極大的挑戰。本研究結果表明，產生金屬酶的銅綠假單胞菌對各類抗生素耐藥率高，達70%以上，根據中國CHINET的數據，銅綠假單胞菌對各種抗生素的耐藥率一般都是30%左右[8-9]，而攜帶了金屬酶大大提高了其耐藥率，且出現多藥耐藥株甚至是泛耐藥株。在住院患者中，大部分患者都是內科和ICU，占63.5%，國內外報道表明，ICU一直以來都比院內其他部門耐藥率要高[10-11]。Lodise等[12]認為，由于ICU收治的患者多為重患者，患者免疫功能低下，診療過程中的各種侵襲性操作和大量廣泛使用廣譜抗菌素，致使入住ICU成為多藥耐藥株產生的危險因素。

檢測金屬酶的方法有許多，入PCR法、E-test法、三位試驗、紙片增效法及紙片協同法，本文利用金屬酶的特征：二價金屬離子與EDTA等有機絡合劑絡合的關系，從而觀察抑菌圈增大來判斷細菌是否產生金屬酶[13]。此方法操作簡單，經濟，快捷，非常適合臨床篩選金屬酶檢測使用，本院分離的銅綠假單胞菌中金屬β-內酰胺酶的攜帶水平較高，陳鍵[14]研究表明，銅綠假單胞菌金屬酶的檢出率是27.8%，而本研究達37.03%，國外銅綠假單胞菌的金屬β-內酰胺酶檢出率相對較低[15]。由此看出，本院應加強對應金屬β-內酰胺酶方法建立以及管理。

金屬酶又分為先天型和獲得型，銅綠假單胞菌大部分都是獲得型金屬酶，有五種類基因型VIM、IMP、SPM和GIM、SIM，其中最常見的是IMP和VIM。大多數獲得性金屬酶位于可移動的整合子中，少數通過可移動的共同區域（cR）進行轉移[16]。本研究中IMP與VIM基因檢出率分別為28.75%（23/80）與11.25%（9/80），其檢出率與國內同期文獻檢出率基本一致，可見產金屬酶的銅綠假單胞菌更容易導致IMP耐藥。謝才文[4]與肖震等[17]研究報道，IMP檢出率是14.7%（28/190），VIM檢出率11.5%（12/104），而整合子檢出率達金屬酶菌株的82.5%（66/80），這也表明了大多數獲得性金屬酶都位于整合子中，使得菌株攜帶的耐藥基因更容易在院內廣泛傳播，增加了院內感染耐藥性菌株機會，此外，這次研究中亞胺培南耐藥菌株中Ⅰ整合子陽性率占85.71%（48/56），Shinobu等[18]研究表明，金屬酶在強啟動子下表現高活性，從而引起亞胺培南耐藥，這或許能推測出本研究中亞胺培南耐藥與整合子的相關性由此引起。

由于本院感染的銅綠假單胞菌產金屬β-內酰胺酶的檢出率較高，且其耐藥率較非產酶的銅綠假單胞菌明顯增高，因此，在臨床用藥治療時必須依據藥敏試驗結果選擇敏感的抗生素成為治療關鍵。院內應加強銅綠假單胞菌的金屬β內酰胺酶的監測，同時了解其科室分布狀況及藥敏情況，分析耐藥趨勢，以便采取適當及時的有效措施控制銅綠假單胞菌院內感染廣泛擴散，提高治療成功的幾率。

[1]何紫琪，李從榮，楊艷兵，等.銅綠假單胞菌1238株對碳青霉烯類抗生素耐藥性分析[J].職業與健康，2012，28（10）：1216-1220.

[2] Boonkerd N，Pibalpakdi P，Tiloklurs M，et al.Class 1 integron containing metallo beta-lactamase gene blaIMP-1 in carbapenemresistant Pseudomonas aeruginosa in Thailand[J].J Infect Chemother，2009，15（4）：257-261.

[3] Yousefi S，Farajnia S，Nahaei M R，et al.Detection of metalloβ-lactamase-encoding genes Among clinical isolates of Pseudomonasaeruginosa in northwest of Iran[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2010，68（3）：322-325.

[4]謝才文.銅綠假單胞菌多藥耐藥性分子流行病學研究[D].廣東藥學院，2010.

[5] Ohara M， Kouda S， Ondera M， et al.Molecular characterization of imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa in Hiroshima[J]. Japan Microbiol Immunol，2007，51（1）：271-277.

[6] Franco M R，Caiaffa-Filho H H，Burattini M N，et al.Metallo-betalactamases among imipenem-resistant Pseudomonasaeruginosa in a Brazilian university hospital[J].Clinics （Sao Paulo），2010，65（9）：825-829.

[7] Yousefi S，Nahaei M R，Farajnia S，et al.Class 1 integron and Imipenem Resistance in Clinical Isolates of Pseudomonas aeruginosa：Prevalence and Antibiotic Susceptibility[J].Iran J Microbiol，2010，2（3）：115-121.

[8]朱德妹，汪復，胡付晶，等.2010年中國CHINET細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2011，11（5）：321-329.

[9]張袢博，倪語星，孫景勇，等.2009年中國CHINET銅綠假單胞菌細菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2010，10（6）：436-440.

[10] Dong F，Xu X W， Song W Q，et al.Characterization of multidrugresistant and metallo-β-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa isolates from a paediatric clinic in China[J].Chin Med J，2008，121（1）：1611-1616.

[11] Hadadi A， Rasoulinejad M，Maleki Z，et al.Antimicrobial resistance pattern of Gram-negative bacilli of nosocomial origin at 2 university hospitals in Iran[J].Diagn Microbiol Infect Dis，2008，60（1）：301-305

[12] Lodise T P，Miller C D，Graves J，et al. Clinical Prediction Tool To Identify Patients with Pseudomonas aeruginosa Respiratory Tract Infections at Greatest Risk for Multidrug Resistance[J].Antimicrob Agents Chemother，2007，51（2）：417-422.

[13]陶晶，張俊麗，瞿婷婷，等.銅綠假單胞菌金屬B-內酰胺酶分布及產金屬酶檢測方法比較[J].檢驗醫學，2009，24（2）：145-148.

[14]陳鍵.老年住院患者產金屬酶耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥監測[J].中華醫院感染學雜志，2012，22（110）：2434-2436.

[15] Samuelsen O，BuarL，Giske C G，et al.Evaluation of phenotypic tests for the detection of metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas aeruginosa in a low prevalence country[J].J Antimicrob Chemother，2008，61（4）：827-830.

[16]程曦.耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥機制與金屬酶、整合子的關系研究[D].四川大學，2007.

[17]肖震，范芳華，朱杰.老年人亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌耐藥性研究[J].中華微生物和免疫學雜志，2011，31（8）：718-720.

[18] Shinobu T，Toru N，Fumiaki I，et a1.Overproduction of a Metai o-p-Lactamase by a strong promoter causes high-level imipenem resistance in a clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa[J].Chemotherapy，2008，54（1）：181-187.