耐甲硝唑幽門螺桿菌的差異蛋白質組學

呂麗艷 夏美玲 姚淑娟 劉伯陽 溫達靜

胃癌的發病率和病死率有著明顯的地域性，主要分布在亞洲的一些國家，例如日本、中國和其他東亞國家，有較大的危害性[1]。而感染幽門螺桿菌（Hp）是胃潰瘍、十二指腸潰瘍及原發性胃癌的主要致病因素。根治Hp是預防潰瘍和胃癌的主要臨床策略。甲硝唑作為以往最有效的治療藥物在臨床出現較多耐藥病例，這給Hp的防治帶來較大麻煩[2]。發現耐藥菌株和正常感染菌株的差異，尋找更為有效的治療策略成為當前研究者普遍研究的熱點。蛋白質組學技術已經廣泛應用于癌癥標記物的篩選中、藥物靶標發現及臨床疾病的早期診斷中。蛋白質組學技術，如高壓液相色譜、二維電泳、表面增強激光電離質譜等，在生物學領域越來越多地發揮著重要作用。本實驗應用二維電泳串聯MALDI-TOF的方法，分析正常Hp菌與耐甲硝唑Hp菌的蛋白表達差異，從而為發現藥物靶點提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 Hp 26695菌株（上海第二醫科大學惠贈）。

1.2 實驗儀器與試劑 質譜儀美國AB公司VOYAGER Biospeetromet；雙向凝膠電泳儀器：安瑪西亞有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、三輕甲基胺基甲烷(TriS)、甘氨酸、漠酚藍、乙二胺四乙酸均購自德國Merck公司；碘乙酞胺(IAM)、低熔點瓊脂糖凝膠購自美國Sigma公司；甲酸、碳酸氫銨從美國Fisher公司購買；測序級胰酶、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制劑Roehe公司購買；線性IPG膠條購自GE Healtheare Amersham公司。其他化學試劑主要購于本地化學試劑公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗甲硝唑Hp誘導 將Hp 26695接種于瓊脂平板，置于37℃微需氧環境中培養，接種于含不同濃度甲硝唑（1，2，4，8，16μg/mL）的液體培養基中，置于微需氧環境培養72h，觀察Hp是否被抑制，選出耐藥株。然后在不含甲硝唑的培養基中連續傳3次，檢測耐藥性形成的穩定性。

1.3.2 樣品制備 正常和耐藥Hp分別培養于大約20個9cm×9cm平板，微需氧條件培養，收集細菌，7000g，離心30min，收集沉淀，提取總蛋白，通過2-DE技術分離，凝膠顯色，得到蛋白質雙向凝膠電泳圖譜，利用Image Master軟件進行圖像分析，尋找敏感株與耐藥株的差異性蛋白質斑點。以2倍或2倍以上變化的為差異點，共29個點進行質譜鑒定。

1.3.3 質譜檢測 利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀進行差異點鑒定。通過分析軟件分析得到的質譜結果。

1.3.4 數據庫檢索 UCSF數據庫檢索蛋白功能。

2 結果

2.1 敏感hp株與耐甲硝唑Hp株二維電泳結果見圖1、2。

圖1 敏感Hp二維電泳圖

圖2 耐藥Hp二維電泳圖

2.2 通過軟件分析，差異點大于等于2倍的凝膠通過MALDI-TOF質譜鑒定，我們共發現27個差異蛋白質。耐藥菌株與敏感菌株相比，8個蛋白表達下降，19個表達上升。功能涵蓋：熱休克蛋白、細胞呼吸鏈相關酶類、細胞壁及鞭毛合成的部分結構蛋白、金屬離子轉運蛋白和DNA突變蛋白等功能性蛋白質。主要蛋白的質譜信息，見表1。部分質譜檢測結果見圖3、4。

圖3 蛋白UvrABC system protein A質譜鑒定圖

圖 4 蛋白Chaperone protein HtpG質譜鑒定圖

表1 差異蛋白質譜檢測結果

3 討論

目前世界范圍內根治Hp感染的方案主要是抗生素聯合治療。2種或3種抗生素共同作用可以有效根除Hp，但是目前臨床的抗藥性情況越來越嚴重，使醫務工作者們不得不關注抗藥性產生的各種相關因素。其中耐甲硝唑Hp的臨床研究是主要研究方向。有研究發現Hp對甲硝唑的耐藥機制與rdxA、frxA和fdxB基因突變相關，其中rdxA基因編碼對氧不敏感的NADPH硝基還原酶，frxA編碼NADPH flavin oxidoreductase，fdxB編碼ferredoxin-like protein蛋白。

本研究中發現，耐藥Hp菌株與敏感株比較，表達水平增高的蛋白主要的是Chaperone protein HtpG、（一種熱休克蛋白）、UvrABC system protein A、Transcription-repaircoupling factor（UvrB family，破壞DNA 結構）、adenosine tRNA methylthiotransferase MiaB（離子轉運）、Flagellar hook-associated protein 2（鞭毛形成），Protein translocase subunit SecA（ATP結合和金屬離子轉運蛋白）、NADP-specific glutamate dehydrogenase、Uracil-DNA glycosylase、MutS2 protein等，可以分析得出結論：耐甲硝唑Hp菌株應變外界變化，熱休克蛋白增加；而抗生素的外界壓力誘使細菌DNA突變和錯配率升高；為了更好定植，鞭毛形成蛋白也起到錨定的作用，對抗外界環境變化；同時為了更好地適應外界抗生素環境，細菌需要更強的呼吸作用，所以一些和呼吸相關的酶類數量上升較為明顯。

本研究中同時發現，耐藥菌株與敏感株比較表達水平降低的蛋白質主要是Uncharacterized aminotransferase HP_0736、Elongation factor G、Protein translocase subunit SecA ATP、Translation initiation factor IF-2、Histidine-tRNA ligase、Molybdopterin synthase catalytic subunit等，主要的都是擔任細菌分解作用的和代謝有關的酶類，可以推論細菌在適應外界抗生素環境時，分解和代謝能力下降，以適應外界不良環境。這些結果與一些文獻[3-4]的研究有部分被提及，但本文發現的引起DNA錯配和突變蛋白質如：MutS2 protein，及部分代謝類蛋白質尚無報道。有待進一步研究探索。

總之，研究本文相關功能蛋白質變化情況可以得出結論，敏感菌株和耐甲硝唑Hp中相關基因已經發生突變，其中呼吸鏈相關蛋白和金屬轉運蛋白，熱休克蛋白可以進一步進行功能研究，從而篩選耐甲硝唑菌株差異的相關蛋白作為藥物靶點[5]：例如DNA突變和錯配的蛋白質MutS2 protein可以考慮作為抗藥靶點，從而為科研及臨床Hp治療提供有力的理論依據和研究方向。

[1]郭剛，鄒全明.幽門螺桿菌的基因組及蛋白質組學研究進展[J].世界華人消化雜志，2003，11(12)：2022-2026.

[2]Rizzato C,Kato I,Plummer M,et al.Risk of advanced gastric precancerous lesions in Helicobacter pylori infected subjects is influenced by ABO blood group and cagA status[J].Int J Cancer.2013 Jul 15;133(2):315-322.

[3]Jenks PJ,Edwards DI.Metronidazole resistance in Helicobacter pylori[J].Int J Antimicrob Agents,2002,19(1):1-7.

[4]劉琳娜，張靜，丁士剛，等.胃癌高低發區胃癌與慢性胃炎患者幽門螺桿菌差異蛋白質的比較[J].北京大學學報：醫學版，2011，43（6）：827-832.

[5]Tanih NF，Ndip LM，Ndip RN.Characterisation of the genes encoding resistance to metronidazole（rdxA and frxA）and clarithromycin (the 23S-rRNA genes) in South African isolates of Helicobacter pylori[J].Ann Trop Med Parasitol，2011，105(3)：251-259.