高鹽誘導幽門螺桿菌致蒙古沙土鼠胃部病變的研究

柳云恩，施琳，張玉彪，徐婷婷，張繼存，侯明曉

（沈陽軍區總醫院全軍重癥戰創傷實驗室·遼寧省重癥創傷器官保護研究重點實驗室，沈陽 110840）

幽門螺桿菌（H.pylori）在全球人群中的感染率高達50%，它與慢性胃炎、消化性潰瘍及胃癌的發生密切相關［1］。H.pylori感染的大部分宿主人無任何癥狀，少數發展為胃炎及胃癌。蒙古沙土鼠（MGs）腺胃結構和功能與人類極其相似，極少患自發性胃炎。H.pylori不僅能長期在MGs胃黏膜定植，且胃黏膜發生的病理變化與人類相似。潰瘍分離株TN2GF4感染MGs，可出現活動性胃炎、潰瘍和高分化腺癌［2］。潰瘍分離株7.13感染MGs 14w后，33%MGs發生高分化腺癌，18w后，50%MGs發生高分化腺癌［3］，其子代菌株B128僅能導致MGs發生輕度潰瘍和胰腺炎［4］。

高鹽飲食及遺傳因素是胃癌發生的危險因素，長期高鹽飲食的MGs易發生萎縮性胃炎及腸化生［5］，高鹽造成胃黏膜短暫性損傷，破壞黏膜表面黏液屏障，利于H.pylori在胃內定植［6］。用含不同鹽濃度培養基培養的H.pylori26695，cagA蛋白表達隨鹽濃度升高而增加［7］，而經高鹽誘導后G27H.pylori菌株逐漸停止繁殖，最終死亡［8］。結果提示H.pylori對高鹽環境的耐受能力存在菌株的異質性，某些來源的H.pylori菌株對高鹽環境更敏感。目前關于高鹽誘導H.pylori菌株致病能力的研究仍停留在體外實驗階段，高鹽環境誘導不同來源H.pylori在體內的致病能力尚未見報道。本研究探討高鹽環境培養的H.pylori菌株對MGs胃黏膜的損傷，旨在闡明在體內環境下高鹽對H.pylori致病變作用的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

90只雄性SPF級MGs，6周齡，購自浙江省醫學科學院實驗動物中心。動物飼養環境：室溫23±2℃，相對濕度40%～60%，12h明暗循環，噪音＜60dB，自由攝食飲水。試驗過程完全接受本中心動物管理委員會（IACUC）監督。

1.2 H.pylori菌株培養及鑒定

胃癌分離H.pylori株和高鹽誘導胃癌H.pylori株。將細菌復蘇，接種于含7%脫纖維羊血，0.4%IsoVitaleXEnric-hment（USA，Becton Dickinson），0.08%兩性霉素 B（USA，sigma），0.2%萬古霉素（USA，lilly）和0.5%磺胺增效劑（USA，sigma）的腦心浸液瓊脂培養基（USA，B-ecton Dickinson），在37℃，含5%O2、10%CO2、85%N2，相對濕度95%的三氣培養箱中培養。幽門螺桿菌鑒定采用典型形態學觀察，尿素酶實驗，Giemsa染色及PCR技術。

1.3 H.pylori接種

MGs觀察及適應環境7d后，將90只MGs隨機分成對照組（n＝30只）、H.pylori組（n＝30只）和高鹽誘導H.pylori組（n＝30只）。所有MGs在接種前16h禁食、禁水，實驗組分別經灌胃針注入H.pylori或高鹽誘導H.pylori（1×108CFU/mL）1mL，對照組僅灌喂生理鹽水，均1次/d，連續3d，連續觀察73w。

1.4 病理學檢查

接種H.pylori后第13周及26周，每組分別處死5只MGs，第73周處死所有存活MGs。處死前MGs禁食禁水12h，乙醚吸入麻醉，對MGs胃黏膜進行仔細的大體觀察。從前胃、腺胃至十二指腸縱向切成3～5mm寬條塊，石蠟包埋制作病理組織切片。

1.5 統計學分析

采用SPSS 18.0統計學軟件進行χ2檢測，比較細菌定植密度及病變發生率等計數資料的組間差異，所有統計檢驗均為雙側概率檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 H.pylori在MGs胃黏膜定植能力

從13～73w，對照組所有MGs胃黏膜均未發現H.pylori感染；H.pylori組及高鹽誘導H.pylori組MGs胃黏膜均發現細菌定植，而高鹽誘導H.pylori組細菌定植密度明顯降低（P＜0.05）（見圖1）。

圖1 免疫組化染色結果

2.2 H.pylori致MGs胃黏膜大體改變

從13～73w，對照組MGs胃黏膜未發現病變。13～26w，高鹽誘導H.pylori組胃黏膜糜爛/潰瘍發生率顯著高于H.pylori組（P＜0.05），且黏膜糜爛/潰瘍程度較H.pylori組重（見圖2）。

圖2 MGs胃黏膜糜爛/潰瘍改變

2.3 H.pylori致MGs胃黏膜病變差異

對照組MGs胃黏膜未見明顯異常。高鹽誘導H.pylori組MGs胃黏膜發生慢性炎癥、變性、腺體萎縮及腸化生的發病率均明顯低于H.pylori組（P＜0.05）；糜爛/潰瘍及小凹上皮增生發生率明顯高于H.pylori組（P＜0.05）。

3 討論

H.pylori通常聚集在表面黏液層內或黏附在表面上皮上，極少寄居在腺體黏液內，當胃黏膜發生慢性炎癥或彌漫性糜爛/潰瘍時，易導致黏膜上H.pylori定植密度明顯下降［9］。高鹽環境是否影響H.pylori的定植能力尚不明確。本研究發現，經高鹽誘導H.pylori在MGs胃黏膜的定植密度明顯降低，體外采用高鹽誘導H.pylori與GES-1細胞共培養，發現高鹽誘導H.pylori黏附細胞的能力明顯下降［10］。有研究發現高鹽飲食能導致小鼠胃黏膜損傷，從而有利于H.pylori在胃黏膜定植［11］。而Loh等［7］則發現高鹽環境易造成H.pylori活力降低及形狀改變，不利于在胃黏膜定植，與本實驗結果類似。

高鹽誘導H.pylori組導致MGs胃黏膜病變與H.pylori組明顯不同，高鹽誘導H.pylori組更容易導致黏膜小凹上皮增生和糜爛/潰瘍等病變，而H.pylori組易誘發黏膜炎癥及萎縮性病變。Fox等［6］發現0.25%鹽導致動物胃體及胃竇黏膜小凹上皮伸長，壁細胞多灶性減少，黏膜或黏膜下層炎癥反應不明顯。高鹽飲食和H.pylori感染以協同作用的方式加重MGs黏膜損傷，黏膜損傷勢必啟動自身的修復程序，導致胃黏膜反應性增生。然而，有研究［12］認為胃黏膜增殖程度與慢性炎癥刺激相關，而與H.pylori感染無關。有研究認為H.pylori生長的最適鹽濃度是0.5%～1%，2%鹽濃度抑制其生長［13］。前期體外實驗研究發現高鹽誘導胃癌來源的H.pylori，CagA及UreB毒性蛋白仍保持較高水平。本研究發現高鹽誘導H.pylori的致病性與常規培養的H.pylori存在顯著差異，可能與高鹽環境導致H.pylori某些特異性毒性蛋白表達改變有關。

總之，高鹽誘導H.pylori在體內的致病能力發生改變，高鹽誘導后易誘發胃黏膜增殖、糜爛潰瘍和肥大細胞瘤發生，高鹽誘導H.pylori菌株致病能力改變的具體機制，有待進一步深入研究。

［1］Correa P，Piazuelo MB.Evolutionary history of the Helicobacter pylori genome：implications for gastric carcinogenesis［J］.Gut and Liver，2012，6（1）：21-28.

［2］Elfvin A，Edebo A，B?lin I，etal.Quantitative measurement of nitric oxide and hydrogen peroxide in Helicobacter pyloriinfected Mongolian gerbils in vivo［J］.Scandinavian Journal of Gastroenterology，2007，42（10）：1175-1181.

［3］Romero-Gallo J，Harris EJ，Krishna U，etal.Effect of Helicobacter pylori eradication on gastric carcinogenesis［J］.Laboratory Investigation，2008，88（3）：328-336.

［4］Farnbacher M，Jahns T，Willrodt D，etal.Sequencing，annotation，and comparative genome analysis of the gerbiladapted Helicobacter pylori strain B8［J］.BMC Genomics，2010，11（335）：1-23.

［5］Cover T，Peek RM.Diet，microbial virulence，and Helicobacter pylori-induced gastric cancer［J］.Gut Microbes，2013，4（6）：30-29.

［6］Fox JG，Dangler CA，Taylor NS，etal.High-salt diet induces gastric epithelial hyperplasia and parietal cell loss，and enhances Helicobacter pylori colonization in C57BL/6mice［J］.Cancer Research，1999，59（19）：4823-4828.

［7］Loh JT，Torres VJ，Cover TL.Regulation of Helicobacter pylori cagA expression in response to salt［J］.Cancer Research，2007，67（10）：4709-4715.

［8］Gancz H，Jones KR，Merrell DS.Sodium chloride affects Helicobacter pylori growth and gene expression［J］.Journal of Bacteriology，2008，190（11）：4100-4105.

［9］Xu Y，Jing JJ，Gong YH，etal.Changes in Biological and Virulent Characteristics of Helicobacter pylori Exposed to High Salt［J］.Asian Pacific Journal of Cancer Prevention，2011，12：2637-2641.

［10］Toyoda T，Tsukamoto T，Yamamoto M，etal.Gene expression analysis of a Helicobacter pylori-infected and highsalt diet-treated mouse gastric tumor model：identification of CD177as a novel prognostic factor in patients with gastric cancer［J］.BMC Gastroenterology，2013，13（1）：122.

［11］Tsukamoto T，Toyoda T，Mizoshita T，etal.Helicobacter pylori infection and gastric carcinogenesis in rodent models［C］.Seminars in immunopathology.Springer-Verlag，2013，35（2）：177-190.

［12］Rogers AB，Taylor NS，Whary MT，etal.Helicobacter pylori but not high salt induces gastric intraepithelial neoplasia in B6129mice ［J］.Cancer Research，2005，65 （23）：10709-10715.

［13］Gancz H，Merrell DS.The Helicobacter pylori Ferric Uptake Regulator（Fur）is essential for growth under sodium chloride stress［J］.The Journal of Microbiology，2011，49（2）：294-298.