Mda7基因增強放射線抑制前列腺癌PC-3細胞生長的作用

殷振娥 何淑梅 劉永哲 金順子 吳叢梅 (長春工業大學化學與生命科學院，吉林 長春 300)

目前，在我國前列腺癌的發病率正呈逐年上升趨勢，尤其是中老年患者比例增長較快。傳統的治療方法都具有局限性，嚴重影響了治療效果和患者的生活質量〔1，2〕。隨著分子生物學技術的不斷發展，將基因治療作為傳統治療方法的輔助手段，集兩種治療方法的優點，避免各自的局限性，是目前研究前列腺癌治療方法的主要方向之一。放射治療是治療前列腺的重要手段之一〔3〕，但是由于其能對腫瘤鄰近部位的正常組織造成損傷，而且很多前列腺癌類型具有輻射抗性，使放射治療前列腺癌的療效和應用受到限制〔4，5〕。研究證實，白細胞介素-24(IL-24)基因可以有效殺傷腫瘤細胞，對正常組織卻沒有損傷，同時可以提高機體的免疫功能，是一種理想的腫瘤治療基因〔6～8〕。因此就將IL-24基因作為放療的輔助基因，通過提高腫瘤細胞的放射敏感性，來增強前列腺癌的放療效果進行實驗觀察。

1 材料與方法

1.1 細胞系和細胞培養 人類前列腺癌細胞系PC-3，來自于中國長春吉林大學，用含10%胎牛血清、RPMI-1640培養基常規培養(GIBCO-BRL;Grand Island，NY，USA)。

1.2 質粒 pcDNA-Mda7質粒由吳叢梅博士構建。即將Mda7 cDNA插入pcDNA3.1(+)質粒中，然后將pcDNA3.1(+)質粒和pcDNA-Mda7質粒經脂質體lipofectamine(GIBCO-BRL;USA)包裹轉染到細胞中。

1.3 方法

1.3.1 集落形成分析 PC-3細胞接種在6孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)中，24 h后，培養基換成無血清DMEM培養基，并將pcDNA-Mda7質粒通過脂質體轉染到細胞中。6 h后，培養基換成完全培養基。轉染8 h后，胰蛋白酶消化，計數。將細胞吹打成單細胞重新接種到90-mm的培養皿(Nunc，Roskilde，Denmark)中，繼續孵育到肉眼可見的集落，14 d后計數這些集落，并計算出集落形成百分比。

1.3.2 細胞凋亡測定 放射誘導凋亡實驗中，PC-3細胞接種到 12 孔板內，24 h 后給予不同劑量 X-射線(0，2，5，10，20 Gy)照射。X-射線照射24 h后，PC-3細胞系經碘化丙啶(PI)染色，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。基因誘導凋亡實驗中PC-3細胞接種12孔板，24 h后，經脂質體包裹，將pcDNA3.1(+)質粒和重組質粒pcDNA-Mda 7質粒分別轉染到PC-3細胞內，同時設空白對照組。24 h染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。聯合誘導凋亡實驗中，PC-3細胞接種于12孔板，分別給予不同的處理:(1)轉染組，于接種24 h后，細胞轉染pcD-NA-Mda 7質粒;(2)照射組，于拉種32 h后，細胞分別給予2和8 Gy的X-射線照射;(3)聯合應用組，于接種24 h后，細胞轉染pcDNA-Mda 7質粒，于接種32 h后，分別給予2和8 Gy和X-射線輻射。于接種38 h后，各組細胞用胰蛋白酶消化，用流式細胞儀檢測細胞凋亡的變化。對照組沒有經過轉染或照射處理。

1.4 X-射線照射 X-射線照射機(Model X.S.S.205 FZ;吉林大學)，劑量率為 0.287 Gy/min，200 kV，10 mA，0.5 mm Cu/0.5 mm Al的過濾器。源物距56 cm。

1.5 統計學方法 應用SPSS10.0統計軟件進行分析，數據資料以±s表示，組間比較采用χ2和t檢驗。

2 結果

2.1 輻射誘導PC-3細胞凋亡 X-射線輻射誘導PC-3細胞細胞凋亡呈劑量隨照射劑量升高而增加。2 Gy和5 Gy X-射線可以誘導PC-3細胞凋亡〔(7.04±1.41)%、(8.24±0.33)%〕，但與0 Gy對照組相比沒有顯著性差別〔(6.15±0.24)%〕。10 Gy和 20 Gy X-射線照射后，PC-3細胞凋亡率明顯增加〔(8.74±0.35)%，(20.78±1.95)%，P＜0.01〕，是 0 Gy對照組的1.58～3.38倍。

2.2 Mda7誘導PC-3細胞凋亡 與空白對照組和轉染pcDNA3.1(+)質粒的細胞相比，pcDNA-Mda7質粒轉染組細胞凋亡率明顯高于其他兩組(P＜0.001)。因此表明，pcDNA-Mda7質粒能夠在PC-3細胞中正常表達，并誘導PC-3細胞凋亡。

2.3 Mda7抑制PC-3細胞集落形成 PC-3細胞接種6孔板，將pcDNA3.1(+)質粒和重組質粒pcDNA-Mda7質粒分別轉染到PC-3細胞內，同時設空白對照組。采用集落形成法檢測Mda7抑制PC-3細胞生長的作用。(A)正常細胞對照組，細胞集落形成最多;(B)pcDNA3.1(+)質粒轉染組，細胞集落形成比正常細胞對照組多;(C)pcDNA-Mda7質粒轉染組，細胞集落形成最少。計數集落形成數并統計分析，結果表明，pcDNAMda7質粒轉染組細胞集落形成數量最低，為(620±18)個，明顯低于正常細胞對照組〔(1 288±141)個，P＜0.001〕和pcDNA3.1(+)質粒轉染組〔(1 104±107)個，P＜0.001〕，約為正常對照組的0.5倍。見圖1。

圖1 PC-3細胞集落形成

2.4 X-射線聯合pcDNA-Mda7誘導PC-3細胞凋亡 與對照組相比，單純pcDNA-Mda7質粒轉染組細胞凋亡率是(9.64±0.69)%，單純8 Gy的 X-射線照射組細胞凋亡率是(7.67±1.23)%，這兩組明顯高于對照組〔(4.98±0.16)%，P＜0.01〕;而單純2 Gy X-射線照射組細胞凋亡率是(6.35±0.31)%與對照組相比沒有明顯變化;在聯合應用組中，轉染了pcDNA-Mda7質粒的PC-3細胞并分別給予2 Gy和8 Gy X射線照射，細胞凋亡率分別為(12.74±2.68)%和(18.39±0.17)%明顯高于對照組和2、8 Gy單純X-射線照射組和單純轉染組(P＜0.01)。

3 討論

多種前列腺癌對輻射的抗性使這種惡性疾病的臨床治療方法受到限制，也影響了治療結果，有研究報道，Mda7基因可以抑制前列腺癌細胞的生長〔8，9〕，也可以增強某些腫瘤細胞的放射敏感性〔6〕。

在本研究中，選擇前列腺癌細胞株PC-3，首先檢測其輻射敏感性，結果證實PC-3細胞具有輻射抗性;同時Mda7基因可以用來抑制PC-3細胞生長，但是，由于分子生物學技術發展有限，作為單獨的基因治療，受到安全性和有效性的限制。2 Gy照射與pcDNA-Mda7質粒轉染聯合應用，可以顯著提高細胞凋亡率。此結果說明，聯合應用可以達到提高腫瘤治療效果和減輕對正常組織損傷的目的。本研究結果初步確定了聯合應用的優勢，為下一步的機制研究和應用提供了實驗基礎。

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