胰島素對人食管鱗癌細胞化療增敏的影響及作用機制

溫豐標 趙 松 楊 洋 劉東雷 吳 愷 趙 佳 齊 宇

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州大學腫瘤分子外科研究所 鄭州市胸部腫瘤重點實驗室，河南 鄭州 450052)

化療作為一種全身性治療方法應貫穿于多種腫瘤治療的始末〔1〕;腫瘤細胞在治療過程中產生的耐藥性，已經成為影響化療治療效果的主要因素〔2〕。因此，迫切需要一種方法增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。胰島素作為代謝促進劑，已有研究在體外證實了胰島素可以增加肺癌、肝癌、結腸癌細胞對順鉑、阿霉素、5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性〔3，4〕。然而有關胰島素化療增敏的作用機制還不甚明了。本實驗旨在探究胰島素對EC9706細胞化療敏感性的影響，觀察自噬和凋亡在化療增敏過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 食管鱗癌EC9706細胞株引自河南省腫瘤病理重點實驗室凍存細胞。MTT噻唑藍(美國Sigma公司)、DDP順鉑(江蘇豪森藥業股份有限公司)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物)、單丹磺酰戊二胺(MDC)熒光染料(美國Sigma公司)、胰島素注射液(上海第一生化藥業有限公司)、BD FAC CantoⅡ流式細胞儀(BD公司，USA)、免疫熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)、酶標儀等。

1.2 MTT法〔5〕測定細胞活力 選對數生長期細胞，接種于96孔板，加入順鉑和(或)胰島素溶液，恒溫孵箱中培養。實驗結束前4 h加入MTT試劑繼續孵育4 h，翻板棄上清，加入二甲基亞砜。待藍紫色結晶充分溶解后用酶標儀測定每孔OD值，計算生長抑制率。生長抑制率(IR)=1-(實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%，實驗重復3次，取平均值。

1.3 熒光顯微鏡下定性檢測T1、T2平臺期細胞自噬和凋亡的表達 自噬泡(AV)的染色方法按 Biederbick等〔6〕方法來進行。EC9706細胞在140 μg/ml的順鉑溶液中培養，分別在0、6、12、24、48 h檢測細胞活力，繪制 OD 值-時間曲線，尋找細胞數量達到平臺期的時間點T1。再次鋪板，加入順鉑溶液培養至T1時間點后，再加入10 mU/ml的胰島素，分別在T1、T1+3 h、T1+6 h、T1+9 h檢測細胞活力，再次繪制 OD值-時間曲線，尋找細胞數量再次達到平臺期的時間點T2。選取在T1、T2平臺期細胞，加入0.05 mmol/L的MDC溶液，37℃避光孵育60 min后棄去染液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定15 min;倒置熒光顯微鏡下觀察并照相。消化、離心收集懸浮細胞，冷的PBS洗滌細胞，400 μl 1×Annexin V 結合液懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC染色液，混勻后2℃ ～8℃避光孵育15 min，加入10 μl PI染色液，2℃ ～8℃避光孵育5 min。立即在熒光顯微鏡下觀察熒光情況。

1.4 流式細胞術(FCM)定量檢測T1、T2平臺期細胞自噬、凋亡水平 收集T1、T2平臺期細胞制成單細胞懸液。MDC染色，流式細胞術檢測MDC染色的熒光強度。Annexin V-FITC和PI染色，上機檢測細胞凋亡。

2.3 T1、T2平臺期時間點的確定 DDP作用24 h時活細胞數量達到平臺期，即T1時間點為24 h(圖2a)。在T1平臺期基礎上加入胰島素溶液，繼續培養6 h后，活細胞數量再次達到新的平臺期T2，即T2時間點為30 h(圖2b)。

2.4 光鏡下觀察細胞形態變化 正常培養的EC9706細胞為多角型，貼壁伸展緊密生長，呈鋪路石狀，折光率高，胞體大。經DDP處理后活細胞數明顯減少，細胞皺縮為圓形、折光率減弱，細胞間距變大，貼壁能力下降，一些細胞脫落漂浮于培養液中，作用時間越長，上述表現越明顯。見圖3。

2.5 T1、T2平臺期細胞自噬水平的比較 熒光顯微鏡觀察MDC染色的AV呈淺綠色點狀結構散布于核周。對照組中很少見到自噬囊泡，T1、T2平臺期細胞中可見到大量MDC染色的AV，以T1平臺期尤為顯著，且每個細胞中自噬囊泡數量較T2時間點明顯增多(圖4)。流式細胞術檢測平均熒光強度，T1平臺期細胞MDC平均熒光強度(104.9±13.2)明顯高于T2平臺期(82.6±10.3)及對照組(13.4±2.5)(P＜0.05)。

圖1 不同濃度DDP對細胞數量的影響

2 結果

2.1 不同濃度胰島素對EC9706細胞數量的影響 胰島素在6～100 mU/ml時，對EC9706細胞增殖影響很小，刺激細胞增殖率最高在10%左右，可以忽略不計。取10 mU/ml作為本試驗的胰島素溶液終濃度。

2.2 DDP終濃度的確定 DDP濃度與OD值之間存在線性相關 關系(見圖1)，相關系數r=-0.001(P＜0.001)，直線回歸方程:OD值=0.462-0.001×DDP濃度(μg/ml)。經計算，DDP作用6 h時抑制率為30%的藥物濃度(即 IR30%)為138.6 μg/ml，故取 140 μg/ml作為加藥濃度。

圖2 T1、T2平臺期時間點的確定

圖3 DDP作用不同時間細胞形態改變(×400)

2.6 T1、T2平臺期細胞凋亡水平的比較 凋亡細胞的細胞膜可以被Annexin V-FITC染色，熒光顯微鏡下可以看到細胞膜呈現明亮的蘋果綠色，PI染色陽性的細胞會在整個胞質內呈現不同強度的黃-紅色。對照組中很少見到Annexin V-FITC染色陽性細胞，T1、T2平臺期可見到較多的陽性細胞，以T2平臺期尤為顯著(圖5)。細胞凋亡流式細胞術檢測發現，T2平臺期細胞凋亡率〔(47.5±5.6)%〕明顯高于 T1平臺期〔(32.6±4.3)%〕及對照組〔(1.5±0.4)%〕(P＜0.01)。

圖4 熒光顯微鏡觀察T1、T2平臺期細胞自噬水平(×200)

圖5 T1、T2平臺期細胞凋亡水平的比較(×200)

3 討論

食管癌起病隱襲，大多數患者在確診時已達中晚期，失去了外科治療的最佳時機，此時新輔助化療和(或)聯合化療為主的綜合治療便成為首選的治療方案。然而，腫瘤細胞耐藥性的產生常常導致化療失敗，臨床工作中迫切需要具有化療增敏作用的藥物。胰島素及胰島素樣生長因子Ⅰ和Ⅱ(IGFs)的合成與分泌在調節腫瘤生長方面扮演著重要角色〔7〕，然而有關胰島素化療增敏的作用機制還不甚明了。

自噬是一個蛋白質降解系統〔8〕，正常細胞通過自噬清除過多的、不必要的蛋白質和受損或衰老的細胞器，維持細胞內環境的平衡。越來越多的證據表明，各種抗癌藥物可以引起不同類型的腫瘤細胞發生自噬〔9〕。然而，自噬在腫瘤化療增敏中發揮著什么樣的作用:是促進細胞死亡，還是幫助細胞存活?目前還存在著諸多爭議〔5，6，10，11〕。研究表明凋亡是化療殺傷腫瘤細胞的主要形式〔12〕，自噬和凋亡在胰島素化療增敏中扮演著什么樣的角色，是我們關注的重點。本研究證實了DDP可以誘導腫瘤細胞發生自噬和凋亡，低濃度胰島素促進細胞增殖的作用微弱，實驗過程中可以忽略不計。在此基礎上本文以新穎的思路探究胰島素化療增敏的機制:先以作用6 h時抑制率為30%的DDP溶液處理人食管鱗癌EC9706細胞，找到活細胞數量達到平臺期的時間T1。在T1平臺期的基礎上加入低濃度胰島素(10 mU/ml)，測得活細胞數量再次達到平臺期的時間T2。利用熒光染色技術，分別對T1、T2平臺期細胞的凋亡和自噬水平進行定性和定量研究。結果顯示胰島素可以增加EC9706細胞對DDP的敏感性，增強細胞殺傷作用。

腫瘤細胞物質、能量代謝活躍，對環境的變化敏感，化療的有害刺激導致大量代謝產物、受損蛋白質和衰老的細胞器在細胞內蓄積。自噬作為細胞內物質降解的重要途徑，如果這個時候受到抑制，將進一步放大化療藥物的細胞毒性作用。筆者推測在DDP作用于EC9706細胞的后期，胰島素可能是通過自噬抑制途徑增加了腫瘤細胞的凋亡，從而實現其化療增敏作用。自噬是腫瘤細胞應對各種抗癌治療的一種自我適應、保護機制，導致耐藥的產生。基于本實驗結果可以考慮腫瘤預防和治療一個新的嘗試方向，即通過藥物和(或)基因抑制自噬，增強癌細胞對化療、放療和靶向治療藥物的敏感性，提高療效，減少毒副作用，延長患者生存時間。

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