大鼠缺氧缺血后海馬神經元凋亡及凋亡抑制蛋白XIAP表達的變化

劉新建 溫慧敏 黃 英 苗耐英 閆向真 谷曉楓

(廊坊市中國石油中心醫院，河北 廊坊 065000)

新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)的細胞死亡主要形式為細胞凋亡，并可出現多種凋亡相關基因表達〔1，2〕。X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)是一種能通過抑制caspase-3、7、9表達而阻止凋亡級聯反應發生的凋亡抑制蛋白〔3，4〕。本實驗通過測定新生大鼠HIBD后不同時間點海馬CA1區神經元凋亡情況及凋亡抑制蛋白XIAP的表達變化，旨在從細胞凋亡的角度探討HIBD病理形成過程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 60只新生7日齡Wistar大鼠為研究對象，由河北醫科大學動物實驗中心提供，雌雄不限，體重12～18 g。實驗儀器及試劑:石蠟切片機(浙江金華無線電廠)、Olympus光學顯微鏡(日本Olympus光學工業株式會社)、捷達JEDA801D形態學圖像分析系統、FACS420型流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)、EnVision試劑盒、鼠抗人XIAP單克隆抗體(工作液濃度為1∶40)購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2 制模 將60只新生大鼠分為假手術組(6只)、正常對照組(6只)、HIBD組(48只)，其中HIBD組根據不同處死時間點分成8個亞組，每組6只。HIBD組制模參照Rice和吳婉芳等的方法。將HIBD組行頸部手術，分離并結扎左側頸總動脈，造成缺血，術后恢復2 h，進入8%O2與92%N2混合氣體環境中缺氧2 h。之后放入母鼠身邊喂養，不作其他處理。假手術組:行頸部手術，只暴露左側頸總動脈，不結扎，也不進行缺氧處理。手術結束時斷頭取腦。正常對照組:不做任何處理，與假手術組同時間斷頭取腦。HIBD制模成功后，分別于不同時間點處死動物取腦:HIBD 后 3、6、12、24、48、72 h、7 和 14 d。

1.3 流式細胞術檢測凋亡 將新鮮缺氧缺血側海馬組織在含有磷酸鹽緩沖液(PBS)中輕柔剪碎，剪碎后組織放離心管中用PBS稀釋為4 ml，反復吹打20次，沉淀5 min，取上清液，經200目尼龍網過濾2次，制成單細胞懸液，以無水乙醇4℃固定12 h，上機前再用PBS稀釋，再次離心去上清液，加入PI染液，4℃避光放置30 min，24 h內應用流式細胞儀檢測。以出現凋亡峰(亞G1峰)為特征。

1.4 檢測XIAP表達 采用EnVision免疫組化染色檢測XIAP表達。染色結果判斷:XIAP定位于海馬神經元胞質，呈棕黃色顆粒狀為陽性信號。每例動物隨機選取5張切片，每張切片在高倍鏡下隨機選取10個視野，計數平均陽性細胞數/mm2。

1.5 統計學處理 應用SPSS13.0軟件，計量資料采用單因素方差分析進行分析，相關性分析采用Pearman等級相關分析。

2 結果

2.1 各組海馬神經元的凋亡率 正常對照組與假手術組海馬神經元凋亡率無顯著差異(P＞0.05)。與假手術組相比，HIBD組缺氧缺血后3 h海馬神經元凋亡率即開始升高，但差異無統計學意義(P＞0.05);于缺氧缺血后12 h凋亡率顯著升高(P＜0.05)，48 h時達高峰，72 h時開始下降，7 d時明顯低于高峰水平(P＜0.05)，而與假手術組無顯著差異，14 d時基本恢復至假手術組水平。見表1。

2.2 各組海馬CA1區XIAP蛋白的表達 正常對照組和假手術組海馬CA1區有極少量XIAP陽性表達細胞。HIBD組于缺氧缺血3 h時XIAP陽性表達顯著升高(P＜0.05)，之后逐漸升高，在48 h時達到高峰，72 h時開始逐漸下降，7 d時已明顯低于高峰水平(P＜0.05)，但仍明顯高于正常對照組和假手術組水平，在14 d時略高于正常對照組和假手術組表達，但差異無統計學意義(P＞0.05)。XIAP蛋白表達與HIBD后各時間點陽性凋亡細胞出現呈負相關(r=-0.564，P＜0.05)。見表1。

表1 各組海馬神經元的凋亡細胞率和CA1區XIAP表達(n=6，±s)

表1 各組海馬神經元的凋亡細胞率和CA1區XIAP表達(n=6，±s)

與假手術組及正常對照組比較:1)P＜0.05

組別 凋亡細胞率(%)XIAP表達(個/mm2)0.50±0.55 2.03±1.05正常對照組 0.33±0.52 1.80±1.03 HIBD組 3 h 2.17±0.98 21.00±4.431)6 h 3.17±1.17 32.00±4.731)12 h 5.67±1.63 45.67±2.881)24 h 13.50±1.871) 62.00±5.221)48 h 23.00±1.411) 75.00±3.161)72 h 10.17±2.321) 53.50±3.271)7 d 2.50±1.05 28.50±1.641)假手術組14 d 0.50±0.55 5.58±1.06

3 討論

動物實驗顯示，HIBD后各腦區均有細胞壞死與凋亡產生，海馬特別是CA1區是中樞神經系統中對缺血缺氧最敏感的區域，是形態學改變和神經細胞死亡和凋亡最顯著的部位〔5〕。本研究結果證實在缺氧缺血腦損傷中存在凋亡現象，且細胞凋亡形式在HIBD中呈動態變化過程〔6〕。細胞凋亡是由多種基因控制的一個細胞自我消亡過程，涉及多種蛋白表達異常而形成了復雜密切的調控網絡聯系，有的甚至起到“開關”樣的作用。其中XIAP是IAPs家族成員中作用最強的成員，在細胞凋亡調控過程中發揮關鍵性作用。已證明XIAP的高表達對腫瘤發生、發展、復發及預后均有重要影響〔7，8〕。本文表明XIAP基因的異常表達出現在HIBD后早期，且高峰表達與神經元細胞凋亡高峰時相相吻合，說明XIAP蛋白過度表達在腦缺氧缺血后細胞凋亡的調控過程中起著重要作用。XIAP對HIBD的腦神經細胞具有保護作用，其異常表達，啟動TNF等介導的信號轉導途徑，可能是海馬神經元凋亡的發生機制之一。

1 李開花，曲云霞.缺氧缺血性腦損傷新生大鼠海馬CA1區NF-κB激活與神經元凋亡的關系〔J〕.廣東醫學，2011;32(1):47-9.

2 劉 英，郭世杰，孫景輝，等.缺氧缺血性腦損傷新生大鼠心肌細胞凋亡及凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達的變化〔J〕.臨床兒科雜志，2011;27(12):1172-6.

3 王麗波，華樹成，劉 偉.老年非小細胞肺癌XIAP蛋白的表達及臨床意義〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(8):1059-60.

4 張麗娜，魏旭東，李玉富，等.X相關凋亡抑制蛋白在86例急性白血病中的表達〔J〕.腫瘤學雜志，2009;15(2):120-2.

5 房清麗，陰懷清，武師潤，等.促紅細胞生成素對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷凋亡的研究〔J〕.中西醫結合心腦血管病雜志，2009;7(4):440-2.

6 Fang QL，Yin HQ，Wu SR，et al.The study of rhEP0 for neuron apoptosis in neonatal rats hippocampus with hypoxic-ischemic brain damage〔J〕.Chin J Integ Med Cardio-/Cerebrovasc Dis，2009;7(4):440-2.

7 何俊義，史穎弘，周 儉，等.凋亡抑制蛋白XIAP在肝細胞癌中的表達及其對肝細胞癌肝移植患者預后的影響〔J〕.中國臨床醫學，2010;17(2):185-7.

8 黃永平，何 健，郭 婷.鼻咽癌組織中XIAP和caspase-3的表達及意義〔J〕.中國現代藥物應用，2011;5(12):47-8.