參龍湯對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及海馬神經肽表達的影響①

雷永紅，陳利平，王發渭，孫志高，許成勇

隨著社會經濟的發展、人們生活水平的提高、生活方式的改變，以及人口老齡化進程的加劇，缺血性腦血管病的發生率不斷升高。有關對缺血性腦血管病導致的學習、記憶損害的保護作用及其神經生物學機制研究一直是神經科學的研究熱點[1]。缺血性腦血管病為中老年人常見病、多發病，嚴重威脅人類生命健康，致殘率高，病理機制復雜[2]。

目前研究認為，缺血性神經元損傷的病理較為復雜，主要過程包括神經細胞的自身損傷機制和腦缺血性損傷級聯反應[3]。缺血性腦血管病是由各種原因引起的慢性腦血流減少，促使腦組織發生病理及生化改變，引起能量代謝障礙、葡萄糖利用減少、蛋白質合成異常、神經遞質改變、膽堿受體缺失、腦白質損害和神經元缺失等，這些構成了慢性腦缺血導致功能障礙的病理生理學基礎[4]。

神經肽(neuropeptide Y,NPY)是一種生物活性多肽，作為神經遞質廣泛分布于中樞神經系統，其作用與學習、記憶、驚厥、疼痛、焦慮、抑郁、攝食等有關[5]。由于缺血性腦血管病的發病機制復雜，目前臨床大多從某一環節或某一途徑治療，采用膽堿酶抑制劑、腦循環改善劑、鈣離子拮抗劑、興奮性氨基酸受體拮抗劑等。近年來，越來越多的學者將目光轉向中醫藥。中醫藥對缺血性腦血管病的治療有著獨特的優勢和較好的療效[6]。既往研究報道，參龍湯具有補腎益氣活血的作用，能提高腦缺血大鼠的學習記憶能力，增強腦缺血大鼠腦海馬區血管內皮生長因子表達[7]。本研究采用慢性腦缺血動物模型，觀察參龍湯對腦缺血大鼠學習記憶能力以及對血漿NPY水平和海馬NPY表達的影響，為臨床治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠，鼠齡3個月，體重180~220 g，雌雄各半，由解放軍總醫院醫學動物實驗中心提供，許可證編號：SCXK(京)2009-0015。

1.2 藥品、試劑及實驗儀器

1.2.1 藥品 ①參龍湯：解放軍總醫院中醫科提供處方，制劑室制備；②吡拉西坦：石家莊中諾藥業有限公司，批號：09075103。

1.2.2 試劑 NPY放射免疫試劑盒：由解放軍總醫院東亞免疫技術研究所生產；NPY多克隆抗體：北京博奧森生物技術有限公司，批號：990901W；二抗顯色試劑盒：EnVision Detection Kit基因科技(上海)有限公司，批號：No.GK500705。

1.2.3 實驗儀器 ①全自動真空脫水機(LEICA ASP300)、組織包埋機(LEICA EG1140H)、石蠟切片機(LEICA RM2135)、展片機(LEICA HI1210)：德國LEICA公司；②光學顯微鏡：日本Olympus BX60系統顯微鏡；③酶標儀：THERMO MultiskanMK3(美國)。

1.3 模型制備與分組

根據文獻[8]制備慢性腦缺血再灌注模型。大鼠禁食12 h，禁水6 h，10%水合氯醛(30 mg/100g)腹腔麻醉，備皮消毒、剪開頸部皮膚，找到雙側頸總動脈，0號絲線結扎。傷口撒頭孢唑啉鈉粉末0.25 g后逐層縫合，放回籠中飼養。假手術組僅分離頸總動脈，不做任何處理。造模后大鼠分為：假手術組，模型組，參龍湯小劑量組、大劑量組，吡拉西坦組，每組大鼠10只。

排除有明顯肢體障礙大鼠，最后納入統計：假手術組10只，模型組8只，參龍湯大劑量組8只、小劑量組9只，吡拉西坦組8只。

術后3 d開始給藥，參照陳奇方法[9]給藥，根據參龍湯和吡拉西坦的臨床口服量，按體重換算出大鼠對應于人的等效量，確定小劑量組、大劑量組和吡拉西坦組分別含生藥80 g/L、240 g/L、90 g/L。大鼠灌胃量為1 ml/d，假手術組、模型組生理鹽水灌胃，連續28 d。

1.4 Morris水迷宮實驗

給藥28 d后進行水迷宮實驗。在暗室中放置一直徑1.3 m、深0.5 m圓形水池，池壁為黑色，標明A、B、C、D四個象限，在任一象限放置一個直徑10 cm，高30 cm安全平臺，水面沒過平臺約2 cm，水中注入適量墨汁，以目視看不到平臺為宜，水溫控制在26℃左右；大鼠訓練2 d，開始實驗5 d，記錄大鼠尋找到安全平臺時間，即逃避潛伏期時間作為學習成績；第6天撤去平臺，選第二象限入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄90 s內大鼠跨越原平臺次數，作為大鼠記憶成績。

1.5 血清NPY含量測定及免疫組化

水迷宮實驗結束后，10%水合氯醛(30 mg/100 g)腹腔注射麻醉取血，血液在冰浴試管中靜置30 min，4℃、3000 r/min離心10 min，分離血清，保存在-70℃冰箱中，按說明進行NPY含量測定。大鼠腹腔注射麻醉取血后斷頭取腦，參照大鼠腦立體定位圖譜[10]，取海馬組織，脫水、包埋，置于APES防脫玻片上。60℃烤片4 h，常規脫蠟、脫水、浸洗；3%H2O210 min，PBS浸洗2 min，共3次；浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液。微波熱修復后，滴加一抗NPY多克隆抗體(1∶200)，假手術組加0.01 mol/L PBS代替一抗，4℃冰箱孵育過夜，室溫復溫30 min后PBS浸洗5 min，共3次后滴加非生物素二抗，濕盒中室溫30 min，PBS浸洗5 min，共3次，DAB顯色，光鏡下控制時間，脫水、透明、封片。采用Image Pro plus 5.1圖像分析系統測定每張照片的陽性細胞。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 學習記憶能力

與假手術組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期時間明顯延長，跨越平臺次數明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，參龍湯大劑量組大鼠的逃避潛伏期時間縮短，跨越平臺次數增加(P<0.05)；而吡拉西坦組僅穿越平臺次數增加(P<0.05)。見表1。

表1 治療后各組大鼠水迷宮學習記憶能力結果

2.2 血漿NPY含量

與假手術組相比，模型組大鼠血漿NPY含量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，治療后參龍湯大劑量組和吡拉西坦組大鼠血漿NPY含量減低(P<0.05)。見表2。

2.3 海馬NPY陽性細胞數

海馬區NPY免疫組化蛋白陽性表達呈黃色或棕黃色染色、深淺不一，主要位于細胞質中，胞核不染色。模型組大鼠海馬區NPY陽性細胞數明顯高于假手術組(P<0.01)；與模型組相比，治療后參龍湯大劑量組和吡拉西坦組大鼠海馬區NPY陽性細胞數減低(P<0.05)。見表2。

表2 治療后各組大鼠血漿NPY含量和海馬NPY陽性細胞數

3 討論

缺血性腦血管病導致神經功能損傷的重要機制之一是缺血后引起的腦組織神經元損傷[11]。本實驗結果顯示，模型組大鼠逃避潛伏期時間較假手術組明顯延長，跨越平臺次數明顯減少，說明造模成功。參龍湯治療后，腦缺血大鼠逃避潛伏期時間較模型組縮短，跨越平臺次數增加，說明參龍湯可以改善腦缺血大鼠學習記憶的能力。

海馬是大腦邊緣系統的重要組成部分，海馬中的遞質包括單胺類神經遞質、膽堿能神經遞質和氨基酸類神經遞質，其合成過程和含量變化都與學習記憶有關。各種神經遞質參與情緒、學習、記憶、行為、免疫調節等，在學習和記憶功能以及調節神經內分泌和自主神經活動中起著重要作用，是參與調節情感、認知行為重要的邊緣系統結構[12]。

NPY是生物活性多肽的一種神經遞質，廣泛分布于中樞及周圍神經組織、心血管系統等部位，在人腦中主要分布于基底節邊緣系統、杏仁核區、海馬回區、下丘腦及感覺運動皮質的運動區等部位[13]。NPY除參與機體眾多生理功能的調節過程外，還與許多腦血管系統疾病的病理過程有密切關系。它除自身具有縮血管作用之外，還能通過加強去甲腎上腺素和5-羥色胺的縮血管效應，導致血管的痙攣。研究顯示，機體在應激等狀態下，NPY水平顯著升高，且與擴血管物質的表達水平呈負相關，提示NPY可以通過抑制舒血管物質的分泌達到抑制血管舒張的作用。

腦缺血缺氧后，反射性地興奮交感-兒茶酚胺系統，使交感神經末梢釋放的NPY與腎上腺素增加，加劇腦部血管的收縮，增加神經元的缺血缺氧損傷程度[14]。本實驗研究結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠血漿NPY的含量明顯升高，腦組織海馬區NPY表達明顯增加；與模型組相比，參龍湯大劑量組和吡拉西坦組大鼠血漿NPY的含量降低，海馬區NPY表達減少，提示參龍湯能降低腦缺血大鼠血漿NPY的含量，減少海馬NPY的表達，通過調節腦血管的舒縮狀態發揮其對腦缺血大鼠海馬神經元缺血損傷的保護作用。

缺血性腦血管病的發生伴隨年齡的增長而逐年增加。中醫認為，缺血性腦血管病的發生與脾腎虧虛、氣虛血瘀痰阻有關。參龍湯是由本科研制的治療缺血性腦血管病的有效方劑，由生曬參、制首烏、淫羊藿、干地龍、石菖蒲、川芎、遠志等藥物組成。其中人參大補元氣、安神益智，為君藥。臣藥制首烏補血養肝、益精固髓；淫羊藿溫腎壯陽，兩者配伍針對腎精不足的基本病機。佐以地龍、川芎活血行氣通絡，去除腦絡之瘀阻。石菖蒲、遠志開竅寧心安神。全方共奏補腎填精、益氣活血、安神增智的功效。前期臨床研究證實，參龍湯對于腦缺血及血管性癡呆具有較好的療效[15-17]。

綜上所述，參龍湯可以改善腦缺血大鼠學習記憶能力。其作用機理之一可能為：參龍湯能降低腦缺血大鼠血漿NPY的含量，減少海馬NPY的表達，通過調節腦血管的舒縮狀態發揮其對腦缺血大鼠海馬神經元缺血損傷的保護作用，其作用與劑量有關。

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