運(yùn)動(dòng)對(duì)胰島素抵抗大鼠瘦素及其受體表達(dá)的影響①

寧采亭，蔡穎，劉遂心，謝康玲，張文亮，劉元

隨著高脂飲食和缺少運(yùn)動(dòng)的生活方式越來(lái)越常見(jiàn)，流行病學(xué)調(diào)查顯示，以胰島素抵抗(insulin resistance,IR)為核心的心腦血管疾病已成為影響人類(lèi)健康和生命最主要的非傳染性疾病[1]。近年來(lái)，大量研究初步表明，運(yùn)動(dòng)可以改善IR；而瘦素抵抗在IR發(fā)生中起著重要作用[2]。我們的前期臨床研究證明，運(yùn)動(dòng)可以降低代謝綜合征患者的血清高瘦素水平[3]。本研究觀察在IR狀態(tài)下血清瘦素水平和組織瘦素受體表達(dá)的變化，以及運(yùn)動(dòng)對(duì)它們的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組 8周齡雄性SD大鼠，體重160~200 g，中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)部。選9只大鼠普通飼料喂養(yǎng)作為對(duì)照組。其他大鼠予高脂高糖飲食喂養(yǎng)6周造模。造模結(jié)束后48 h，對(duì)照組和造模組大鼠均禁食12 h過(guò)夜，于次日尾靜脈采血1 ml，放免法測(cè)空腹胰島素，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index,ISI)。

ISI=ln[1/(FBG×FINS)]

將IR造模成功的34只大鼠隨機(jī)分為4組，各組繼續(xù)予以高脂高糖飲食喂養(yǎng)直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束：①模型組(n=9)：僅予高脂高糖飲食喂養(yǎng)6周；②運(yùn)動(dòng)組(n=9)：予游泳訓(xùn)練[5]6周：保持水溫(33±2)℃，水深50 cm，每只大鼠的活動(dòng)面積200 cm2，第1周每天適應(yīng)性訓(xùn)練30 min，以后每天訓(xùn)練60 min，每周訓(xùn)練5 d；③二甲雙胍組(n=8)：予二甲雙胍300 mg/kg·d灌胃6周；④聯(lián)合組(n=8)：予二甲雙胍灌胃和游泳訓(xùn)練6周，具體方法同二甲雙胍組及運(yùn)動(dòng)組。

1.2 標(biāo)本的采集 各組大鼠在干預(yù)6周后使用剪尾法采血1滴，快速血糖儀測(cè)空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)。干預(yù)結(jié)束后48 h，ES-1100型電子秤測(cè)量大鼠體重。大鼠麻醉，剪斷頸動(dòng)脈，迅速取血置無(wú)菌試管中，4℃下4000 r/min離心10 min，分離血清，-70℃保存。

放血處死大鼠。無(wú)菌條件下迅速于肝右葉、右后肢大腿骨骼肌和大網(wǎng)膜脂肪組織分別剪取約3×3×3 mm組織，液氮保存，用于RT-PCR檢測(cè)；另剪取約5×5×5 mm組織用于免疫組化染色。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 FPG、胰島素 放射免疫法測(cè)空腹胰島素(FINS)。HOMA法計(jì)算IR指數(shù)(IRI)：

IRI=-FPG(mmol/L)×FINS(mIU/ml)/22.5

1.3.2 血清瘦素水平 采用ELISA法。待測(cè)血清與室溫平衡后，PBS緩沖液1∶5稀釋?zhuān)粚?000 pg/ml、2000 pg/ml、1000 pg/ml、500 pg/ml、250 pg/ml、125 pg/ml、62.5 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品各 100 μl依次加入 7 孔中，1孔加樣品稀釋液100 μl作為零孔，1孔為T(mén)MB空白顯色孔。每孔加入稀釋后待測(cè)血清，37℃水浴90 min；甩去酶標(biāo)板內(nèi)液體；每孔加入生物素抗大鼠瘦素抗體工作液100 μl(TMB空白顯色孔除外)，37℃水浴60 min；每孔加入親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物工作液100 μl(TMB空白顯色孔除外)，37℃水浴30 min；37℃平衡TMB顯色避光反應(yīng)30 min。用酶標(biāo)儀在450 nm測(cè)定光密度(OD)值。

1.3.3 瘦素受體蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)法。留取的組織生理鹽水沖洗，10%甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 μm。石蠟切片脫蠟至水。3%H2O2處理，熱修復(fù)抗原；滴加5%山羊血清封閉液，滴加1∶150兔抗瘦素受體IgG，4℃過(guò)夜。滴加生物素化羊抗兔IgG，室溫20 min；滴加SABC，室溫20 min。DAB顯色；蘇木精復(fù)染。用Image pro-Plus圖像分析軟件對(duì)免疫組化染色圖像進(jìn)行定量分析。

1.3.4 瘦素受體mRNA表達(dá) 內(nèi)參比法采用RT-PCR。引物根據(jù)GeneBank中查得大鼠目的基因mRNA序列，再通過(guò)Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)時(shí)均跨越了1個(gè)內(nèi)含子，以使cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物與可能污染的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)別開(kāi)來(lái)。β-actin和瘦素受體引物序列見(jiàn)表1。

表1 β-actin和瘦素受體引物序列

組織勻漿、分相，沉淀RNA，洗滌和溶解；檢測(cè)總RNA純度、濃度及完整性。逆轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系20μl，42℃反應(yīng)1 h，70℃ 10 min。cDNA于-20℃保存。PCR：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min。循環(huán)32次。72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于4℃保存。半定量分析：2.5%瓊脂糖凝膠中加入溴乙啶10 mg/ml，使其終濃度為0.5 μg/ml，成膠后置于電泳槽，加入0.5×TBE緩沖液，取PCR產(chǎn)物5μl與載樣緩沖液1μl混勻點(diǎn)樣，在60 V恒壓下電泳40 min。TANON GIS2020凝膠分析儀數(shù)碼拍照，BandScan V5.0軟件掃描，分析OD值，并與β-actin測(cè)定比值。

2 結(jié)果

2.1 體重、FPG、FINS、IRI及血清瘦素 與對(duì)照組比較，模型組大鼠體重、FPG、FINS、血清瘦素明顯升高(P<0.01)，IRI明顯降低(P<0.01)。與模型組比較，二甲雙胍組、運(yùn)動(dòng)組、聯(lián)合組大鼠體重、FPG、FINS、瘦素降低(P<0.05)，IRI升高(P<0.05)；與二甲雙胍組和運(yùn)動(dòng)組比較，聯(lián)合組大鼠IRI明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 組織瘦素受體蛋白 在肝臟、骨骼肌及脂肪組織中，與對(duì)照組比較，模型組大鼠瘦素受體蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組表達(dá)均明顯升高(P<0.01)，脂肪組織中二甲雙胍組表達(dá)也明顯升高(P<0.01)；與二甲雙胍組比較，肝臟及脂肪組織中運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組表達(dá)升高(P<0.05)，骨骼肌中聯(lián)合組表達(dá)升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 組織瘦素受體mRNA表達(dá) 在肝臟、骨骼肌及脂肪組織中，與對(duì)照組比較，模型組瘦素受體mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組表達(dá)升高(P<0.05)，脂肪組織中，二甲雙胍組表達(dá)也升高(P<0.05)；與二甲雙胍組比較，骨骼肌中，運(yùn)動(dòng)組和聯(lián)合組表達(dá)明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表4。比較，P<0.05。

表2 干預(yù)后各組體重、FPG、FINS、IRI及血清瘦素比較

表3 各組肝臟、骨骼肌、脂肪組織中瘦素受體蛋白表達(dá)比較(OD)

表4 各組肝臟、骨骼肌、脂肪組織中瘦素受體mRNA表達(dá)比較(相對(duì)OD)

2.4 相關(guān)分析 IRI與血清瘦素水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.807,P=0.000)，與瘦素受體蛋白呈正相關(guān)(r=0.776,P=0.002)。

3 討論

IR是引起糖尿病、高血壓、冠心病等代謝綜合征相關(guān)疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。大規(guī)模臨床研究證實(shí)，以運(yùn)動(dòng)為主的生活方式干預(yù)能夠明顯改善IR患者病程進(jìn)展，并減少發(fā)生2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)[6]。合理的行為干預(yù)(飲食、運(yùn)動(dòng))可有效降低IR，從而減少由其引發(fā)的代謝異常[5,7-8]。本研究顯示，運(yùn)動(dòng)能夠明顯改善IR，主要表現(xiàn)為體重減輕，空腹胰島素、空腹血糖水平下降，IRI升高。

瘦素是肥胖基因編碼的一種分泌型蛋白質(zhì)，因其基本作用是使動(dòng)物體重降低而得名。瘦素受體存在于包括下丘腦、肝臟、骨骼肌及脂肪組織在內(nèi)的許多組織器官中[9]。本研究顯示，IR模型大鼠血清瘦素明顯升高，瘦素受體蛋白和mRNA表達(dá)下降，并與IRI相關(guān)。有研究顯示，瘦素可直接作用于胰島細(xì)胞瘦素受體，抑制胰島素的分泌，從而減少脂肪合成，促進(jìn)脂肪分解[10-11]；瘦素受體表達(dá)下降，盡管循環(huán)中瘦素水平高，但效應(yīng)減低，形成所謂瘦素抵抗[12-14]。組織瘦素受體表達(dá)減弱是造成IR的主要原因[7]。

本研究顯示，二甲雙胍和運(yùn)動(dòng)均能降低血清瘦素水平，上調(diào)組織中瘦素受體表達(dá)。與二甲雙胍組比較，運(yùn)動(dòng)上調(diào)瘦素受體作用似更強(qiáng)。

本研究顯示，運(yùn)動(dòng)組FPG、FINS及IRI水平與二甲雙胍組比較無(wú)顯著性差異，提示還存在改善IR的其他機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，IR大鼠存在明顯的高瘦素血癥與瘦素受體表達(dá)下調(diào)，并與IR密切相關(guān)。運(yùn)動(dòng)可以降低胰島素大鼠血清瘦素和上調(diào)組織瘦素受體的表達(dá)，緩解瘦素抵抗，這可能是運(yùn)動(dòng)改善IR的機(jī)制之一。

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