熱休克蛋白27、70在老年性白內障晶狀體上皮細胞中的表達

陳爽 趙清來

凡是由各種因素引起的晶狀體混濁均稱為白內障，是全世界致盲的主要原因，其中最常見的就是老年性白內障，年齡越大發病率越高，但它的發病機制尚不完全清楚。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一種進化上高度保守的細胞應激蛋白，可以保護機體在嚴酷的環境下得以生存。近年來，HSPs的表達與疾病的關系一直被人們所關注，其在晶狀體上皮細胞中表達的特點也成為眼科界研究的一大熱點。為探討HSP27、HSP70在老年性白內障的形成中是否存在作用，我們利用免疫組化方法觀察晶狀體上皮細胞中HSP27、HSP70的表達特點，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 隨機收集2007～2010年本院住院確診為老年性白內障行小切口白內障超乳手術患者102例，男性48例，女性54例，年齡53～88歲，平均(73.55±8.24)歲，其中皮質型36例，核型35例，后囊下型31例。病例均排除高度近視，葡萄膜炎，眼底病變等眼科其他疾病及糖尿病等影響晶狀體代謝的全身性疾病。對照組取自健康尸體眼晶狀體前囊膜5例，為青壯年。

1.2 晶狀體前囊膜的采集及保存 撕取晶狀體中央前囊膜，用生理鹽水干凈后，置于40 g/L多聚甲醛中固定，石蠟包埋，-25℃冰箱中保存備用。

1.3 HSP27、HSP70免疫組織化學觀察

1.3.1 試劑 一抗：鼠抗人HSP27單克隆單體(1：100稀釋)；鼠抗人HSP70單克隆單體(1：80稀釋)；二抗：Envision試劑；DAB顯色劑及Envision免疫組織化學試劑盒；PBS和TBS緩沖液。

1.3.2 實驗步驟 取組織蠟塊制成石蠟切塊平鋪于涂有APES的載玻片上，58℃烤24 h，二甲苯脫蠟，乙醇水化。PBS浸泡3 min×3次，3%H2O2室溫孵育5～10 min。PBS浸泡3 min×3次，將切片置于0.01 molCB液中，98℃微波修復10 min，自然冷卻至室溫。PBS浸泡3 min×3次，加正常血清封閉，室溫作用15 min。傾去多余水分，勿洗。加適量稀釋的一抗，37℃水浴1～2 h。PBS浸泡3 min×3次，加 Envision試劑，37℃水浴10～15 min。PBS浸泡3 min×3次，DAB顯色劑顯色。自來水充分沖洗，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3.3 標本檢測 用已知陽性標本作陽性對照，用PBS代替一抗，結果應為陰性。陽性為細胞核/漿著染為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀彌漫分布。每張切片隨機觀察5個視野，并記錄陽性細胞率。陽性細胞率為5個視野內陽性細胞數占細胞總數的百分比。陽性細胞的分級標準為：-陰性；+陽性細胞＜5%；++陽性細胞5% ～25%；+++陽性細胞25% ～50%；++++陽性細胞50% ～75%；+++++陽性細胞＞75%。

1.4 統計學方法 采用SPSS 11.0軟件，以秩和檢驗對數據進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

老年性白內障與正常晶狀體上皮中均有HSP27、HSP70的表達，但各不相同。

HSP27在正常對照組晶狀體上皮細胞中的表達為(28.40±4.05)%，而在老年性白內障晶狀體上皮細胞中的表達：皮質型為(76.17±2.38)%，核型為(65.83±1.76)%，后囊下型為(57.71±2.15)%，三者與正常對照組相比均有顯著性差異。且三者間差異也有統計學意義，即HSP27的表達皮質型組＞核型組＞后囊下型組。見表1。

表1 HSP27在晶狀體上皮細胞中的表達(n)

HSP70在正常對照組晶狀體上皮細胞中的表達為(29.60±4.95)%，而在老年性白內障晶狀體上皮細胞中的表達：皮質型為(77.31±2.74)%，核型為(63.26±1.76)%，后囊下型為(57.23±2.23)%，三者與正常對照組相比均有顯著性差異。且三者間差異也有統計學意義，即HSP70的表達皮質型組＞核型組＞后囊下型組。見表2。

表2 HSP70在晶狀體上皮細胞中的表達(n)

3 討論

所謂白內障是晶狀體老化后的退行性變，是多種因素作用的結果。晶狀體作為身體中蛋白質含量最高的器官，以重量計可高達濕重的35%，而晶狀體的干重幾乎全為蛋白質［1］。因此分析晶狀體蛋白質的變化，是探討白內障的形成機制的一大方向。

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物體在不良環境因素作用下所產生的一組具有高度保守性的特殊蛋白，而且除了因熱刺激而產生以外，還有很多因素，如重金屬、缺氧、病毒或細菌感染等，都可以誘導其產生，因此也有人稱之為應激蛋白［2］。它普遍存在于整個生物界，幾乎所有的細胞均能合成HSPs，從而參與細胞的損傷與修復。Arrigo等［3］發現，衰老細胞中HSP27的表達量較高，它對過量自由基產生的蛋白氧化，脂質過氧化和DNA損傷都有抑制作用。Li等［4］發現，HSP70通過抑制線粒體細胞色素 C的釋放及Caspase 3的活化來抑制細胞凋亡。在應激狀態下，HSP27、HSP70的表達增加發揮了細胞保護，分子伴侶，信號傳導，凋亡調節等作用，增強了細胞的耐受能力。

近年來的研究表明，晶狀體能表達一系列的熱休克蛋白，它們對維持晶狀體的穩定和透明起到關鍵作用［5］。本實驗采用免疫組織化學染色觀察晶狀體前囊膜上皮細胞中HSP27、HSP70的表達，發現老年性白內障中 HSP27、HSP70的含量均高于正常對照組，HSP27、HSP70的表達增加有利于阻止蛋白間不必要的相互作用，幫助變性蛋白重新折疊，維持了晶狀體蛋白質的正確構象，從而延緩了白內障的發展。本實驗通過比較皮質型、核型、后囊下型晶狀體前囊膜上皮細胞中HSP27、HSP70的表達，還發現各型之間存在顯著差異，其中皮質型HSP27、HSP70的表達＞核型＞后囊下型，故推測這三型白內障的發生機制可能不同，HSP27、HSP70蛋白在皮質型白內障發生機制中作用較強，而在后囊下型作用較弱，其具體作用機制有待進一步研究。

總之，我們可以從熱休克蛋白具有抗氧化，分子伴侶，細胞保護等作用入手，探討HSP27、HSP70在老年性白內障發生機制中的保護作用，為白內障的防治工作提供新視野。

［1］ 劉家琦，李鳳鳴，吳靜安，等．實用眼科學．第二版，北京：人民衛生出版社，2003：383-404.

［2］ Fuller KJ，Issels RD，Slosman DO，Guillet JG，Soussi T，Polla BS．Cancer and the heat shock response．EurJ Cancer，1994；30A(12)：1884-1891.

［3］ Arrigo AP，Ducasse C．Expression of the anti-apoptotic protein HSP27 during both the keratinocyte differentiation and dedifferentiation of HaCat cells：expression linked to changes in intracellular protein organization．Exp Gerontol，2002；37(10-11)：1247-1255.

［4］ Li CY，Lee JS，Ko YG．Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome C release and upstream of Caspase 3 activation．J Biol Chem，2000；275(5)：25665-25671.

［5］ Berry Y．Alpha-B crystalline gene(CRYAB)mutation causes dominant congenital posterior polar cataract in human．Am J Hum Genet，2001；69：1141-1152．