力竭運動對小鼠骨骼肌氧化應激和DNA損傷的影響

蘇美華,陳 平,孫 劍

(1.漳州師范學院體育系,福建漳州 363000;2.呂梁學院體育系,山西呂梁 033000;3.新疆師范大學 體育學院,新疆 烏魯木齊 830000)

骨骼肌是最直接參與運動的器官之一,運動引起組織內抗氧化能力的改變在肌肉表現最為明顯.正常細胞的DNA損傷是疾病的誘因之一,而運動所致的DNA損傷也引起人們極大的興趣.因此本實驗采用單細胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis,SCGE)又稱彗星實驗(comet assay)來觀測力竭運動后即刻、24 h、48 h等不同時相小鼠骨骼肌細胞的DNA損傷效應,并對力竭運動所致骨骼肌氧化損傷進行測定,探討骨骼肌細胞DNA損傷機制,進一步揭示運動性疲勞的外周機制.

1 材料和方法

1.1 動物與分組

選用昆明純系清潔級健康雄性小鼠(購于北京醫科大學動物中心),7~8周齡,體重27.68±2.86 g.分籠飼養,自由飲食,自然光照,動物室內溫度20℃ ±2℃,相對濕度為50% ±5%.動物隨機分為對照組(CG)和運動組(SG);運動組又分為運動后即刻組(0SG)、運動后 24 h組(24SG)、運動后 48 h組(48SG),每組6只,共24只.

1.2 運動疲勞動物模型的建立

根據Marra[7]的運動方案建立運動疲勞動物模型.運動方式為電動跑臺,運動組先進行3天的適應性訓練(速度為10 m/min,坡度為0°).休息2天,從第5天開始進行正式運動.初始速度為10 m/min,在10分鐘內逐漸增加負荷達到28 m/min速度,一直持續到力竭.以這種運動方式持續運動6天.力竭標準:運動末期動物不能堅持原跑速,先后滯跑道后1/3處達3次以上,刺激驅趕無效,停跑后體征表現為呼吸急促,神情倦怠,腹臥位,對刺激反應遲鈍.

1.3 細胞DNA損傷的測定

1.3.1 取材與制備單細胞懸液

小鼠最后一次運動至疲勞后分別在即刻、24 h、48 h脫頸處死,取骨骼肌放培養皿,用預冷的PBS沖洗、剪碎,再將其置于5 ml離心管內(管內含1500μl的PBS),然后加入終濃度0.25%的胰蛋白酶,37℃水浴30 min形成同源混濁液,用200目細胞篩過濾,制得骨骼肌細胞單細胞懸液.

1.3.2 制膠片

膠片制作參照Hartmann[8]的方法稍加改進.1.3.3 電泳和染色

將載玻片置于水平電泳槽中,倒入新配置的堿性電泳緩沖液約覆過膠面0.25 cm左右,解旋20 min,以便使DNA解螺旋成單鏈,使DNA斷片在電泳場中易于遷移.解旋后在25 V、250 mA的條件下電泳40 min.停止電泳后小心地將玻片放入中和緩沖液中中和15 min.取出玻片,滴加30~50μL濃度為5 μg/mL的EB染液到膠體表面,蓋上蓋玻片,染色15~20 min后熒光顯微鏡觀察.

1.4 抗氧化酶與脂質過氧化水平的測定

SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法;MDA測定采用硫代巴比妥酸比色法;蛋白定量測定采用考馬斯亮藍G-250法.試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.

1.5 主要儀器和試劑

電動動物跑臺(BCPT-98型,杭州)、DYY-6C型三恒電泳儀和DYZC-24B型電泳槽(北京,六一);BX-51型熒光顯微鏡和E-330型數碼像機(OLYMPUS).低熔點瓊脂糖(LMA)、正常熔點瓊脂糖(NMA)、肌氨酸鈉、Triton X-100二甲基亞砜(DMSO)及溴化已錠(EB)等均購自Amresco公司;其他試劑均為優級分析純.

1.6 統計分析

熒光顯微鏡下用515~560 nm的激發光觀察,在X100下,每張涂片上隨機觀察5個視野,每個視野多于5個細胞,每組6張載玻片.用IMI1.0(深圳良正軟件開發有限公司)彗星分析軟件測定彗星長、尾長、尾部DNA百分數、彗星分布矩、尾慣量、Olive尾矩等指標,用EXCELL和SPSS軟件對所獲得數據進行正態檢驗(1-Sample K-S)和單因數方差分析(One-Way ANOVA),結果以mean±SD表示.P<0.05表示運動組與對照組之間的差異顯著性.

2 結果

2.1 動物體重的變化

從表1可以看出,實驗前對照組和運動組小鼠體重末見明顯差異(P>0.05).實驗期間隨游泳天數的增加,對照組小鼠的體重自然增長速度略高于各運動組,但組間仍沒有顯著差異(P>0.05).

表1 小鼠體重的變化和運動時間

2.2 力竭運動后小鼠骨骼肌細胞DNA損傷的形態學觀察

染色后在熒光顯微鏡下觀察,陰性對照組骨骼肌細胞經單細胞電泳絕大部分表現為一圓形熒光團,熒光強度均勻,邊緣光滑,即彗星頭部,無明顯拖尾現象(圖4,A);尤其在運動后即刻,不僅典型的彗星樣細胞的出現率明顯升高,彗星的尾巴加長,尾部的熒光強度增強,彗星頭部的直徑隨著尾部的加長而減小(圖4,B);隨著恢復時間的延長,運動后24 h,部分細胞出現"彗星尾",但較即刻組明顯降低(圖4,C);而在運動后48 h,骨骼肌細胞核卻無明顯拖尾,和對照組的形狀差不多(圖4,C、D).

圖4 力竭運動后小鼠骨骼肌細胞DNA損傷的形態學觀察

2.3 SCGE檢測心肌細胞在不同恢復期DNA損傷各指標變化趨勢

彗星圖像經熒光分析軟件統計分析結果見表2,力竭運動后小鼠骨骼肌細胞在即刻和24 h的DNA損傷程度明顯高于對照組,表現為目前國際上廣泛采用的綜合指標彗星分布矩、Olive尾矩、尾慣量、尾分布矩的數據結果明顯高于對照組(P<0.01),其中尾分布矩和尾慣量被認為是計算機分析系統中較好的指標,二者均與DNA損傷的水平存在高度相關性,這是因為DNA損傷越嚴重,導致DNA超螺旋結構越松散,產生的斷裂點越多,DNA片段越小,從彗星頭部跑到彗星尾部的DNA斷片越多,則彗星尾部的長度、面積和熒光強度越大.而力竭后48 h小鼠骨骼肌細胞的DNA損傷參數彗星長、尾長、尾%DNA、遷移率、Olive尾矩都略高于對照組,但這兩個時相之間的差異無統計學意義(P>0.05),可見力竭后48 h DNA損傷基本恢復.DNA受損而發生遷移的各個特征參數在力竭運動后不同恢復期的變化趨勢如表2.

表2 力竭運動后小鼠心肌細胞在不同恢復期的DNA損傷各指標變化趨勢

2.4 力竭運動后小鼠骨骼肌在不同恢復期氧化應激水平的變化

從表3可知,力竭運動后即刻,小鼠骨骼肌組織SOD酶活性都較對照組有非常顯著升高(P<0.01),運動后24 h和48 h組與對照組相比也顯著升高(P<0.05),但較即刻組有下降的趨勢,而無統計學意義(P>0.05).小鼠骨骼肌組織GSH含量在力竭運動后即刻較對照組有顯著的下降(P<0.01),而運動后24 h和48 h組與對照組相比則無顯著差異(P>0.05),但與即刻組相比,GSH含量顯著升高(P<0.05).小鼠骨骼肌組織MDA含量在運動后即刻組和24 h組均較對照組顯著升高(P<0.01),其中即刻組也顯著高于24 h組(P<0.05),而48 h組與對照組相比則無顯著差異(P>0.05).

表3 力竭運動后小鼠骨骼肌在不同恢復期自由基代謝水平

3 討論與分析

在細胞的生存過程中,DNA會遭到內源性和外源性的攻擊,DNA在損傷因素的作用下,主要產生堿基損傷和DNA鏈的斷裂,DNA損傷的主要生物效應是細胞突變和死亡[4].它們的損傷和突變將會對生物體產生嚴重影響,導致一系列生理功能紊亂和組織病理學改變,甚至癌變[5].

自由基能和體內DNA、蛋白質、碳水化合物和脂類等重要的大分子反應,損壞它們的功能,引起一系列的疾病,如癌癥、心血管疾病和衰老等.SCGE技術已成為一種檢測DNA損傷的常用技術,可以相對定量地反映單個細胞內DNA的損傷情況.在本實驗研究中,大強度反復力竭運動后用SCGE技術檢測到了運動后即刻和運動后24 h,DNA的損傷值顯著高于對照組,可見力竭運動對組織細胞的DNA損傷持續到運動后兩天,而在運動后即刻到48 h DNA損傷有降低的趨勢,但運動后48 h的DNA損傷仍顯著高于對照組.從表1可知彗星實驗所選指標都反映出力竭運動后即刻的DNA損傷顯著大于運動后24 h和48 h.力竭運動可導致機體自由基和脂質過氧化水平增加已得到廣泛證實.一些研究報道發現運動性氧應激與細胞DNA損傷有關[6].Forrest[7]等研究認為大強度運動后,隨著自由基的增多,細胞抗氧化能力降低,膜脂質被過氧化后,進一步攻擊位于核小體之間的組蛋白成分,導致堿基修飾、堿基丟失、單鏈和雙鏈DNA的斷裂、DNA交鏈而造成DNA損傷,引起細胞凋亡,造成骨骼肌細胞的微損傷.SOD是需氧生物體數千種酶中底物為氧自由基的唯一酶,作用是歧化O-2生成H2O2,從而阻斷毒性更強的羥自由基產生[8].體內GSH能自行或經GSH-Px催化過氧化氫和過氧化脂質的還原,消除自由基造成的損傷,是細胞抵抗活性氧損害的主要物質,GSH較敏感且能綜合反映組織細胞抗損傷能力及受損傷程度,GSH作為抗氧化劑,保護細胞膜的巰基蛋白和巰基酶不被氧化,并可與其他抗氧化劑協同作用[9].MDA含量的高低可反映體內脂質過氧化的程度,間接地反映細胞受損程度.諸多研究證實,劇烈運動可促使體內活性氧產生、脂質過氧化增強及MDA水平升高而導致運動能力下降,產生運動性疲勞[10].本實驗結果發現,力竭運動后即刻、24 h和48 h的SOD水平都顯著高于安靜對照組,其中即刻組較安靜組最為顯著(P<0.01).運動后即刻組的GSH水平顯著低于對照組,而24 h組和48 h組與對照組相比無顯著差異(P>0.05).MDA水平在運動后即刻和24h都顯著高于對照組(P<0.01),其中運動后即刻MDA水平最為顯著,而運動后48hMDA水平與對照組無顯著差異(P>0.05).從表2可知運動后即刻SOD活性和MDA水平都較安靜對照組有顯著的升高(P<0.01),GSH水平較安靜對照組有顯著的降低(P<0.01),從表1可知運動后即刻DNA損傷程度最為顯著(P<0.01),由此可推論運動性氧應激參與介導了組織細胞的DNA損傷,DNA損傷程度與氧化應激水平呈正相關,SOD活性急劇升高可能是機體運動過程中抗氧化能力代償性增加,以達到減少組織損害的結果.骨骼肌組織GSH水平在運動后24 h和48 h及48 h組MDA水平與對照組相比無顯著差異,而骨骼肌細胞的DNA損傷值在24 h和48 h仍顯著高于對照組,這與DNA損傷的修復程度有關,可能是力竭運動后氧化應激所致骨骼肌細胞的DNA損傷程度較高,因而其修復時間也滯后.

大強度力竭運動可致骨骼肌組織細胞的DNA損傷,其損傷程度在運動后即刻、24 h和48 h等時相有不同的時間效應,在運動后的即刻、24 h和48 h DNA損傷程度顯著高于對照組,隨著運動后時間的推移,DNA損傷程度有降低的趨勢,但到了運動后48 h,彗星各項指標仍顯著高于對照組(P<0.05),而氧化應激水平SOD活性和MDA水平在運動后即刻都有顯著增加(P<0.01),GSH水平在運動后即刻有顯著降低(P<0.01).由此可見力竭運動所致的骨骼肌細胞DNA損傷與氧化應激水平有密切的關系,運動性氧應激參與介導了細胞DNA損傷,運動性氧應激是組織細胞DNA損傷的機制之一,適時有效的抗氧化劑補充將有利于防護組織細胞DNA損傷.

[1]MarraS,BurnettM,Hoffman-GoetzL.Intravenous catecholamine administration affects mouse intestinal lymphocyte number and apoptosis[J].J Neuroimmunol,2005,15(8):76-78.

[2]A Hartmann,E Agurll,C Beevers,et al.Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay[J].Mutagenesis,2003,18(1):45-51.

[3]王小紅,江洪.單細胞凝膠電泳技術的研究進展及其應用[J].國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊,2001,22(1):5-7.

[4]Huang Y,Nakada S,Ishiko T,et al.Role for caspasemediated cleavage of Rad51 in induction of apoptosis by DNA damage[J].Mol Cell Biol,1999,19(8):86-89.

[5]Blaisdell JO,Harrison L,Wallace SS.Base excision repair processing of radiation-induced clustered DNA lesions[J].Radiat Prot Dosimetry,2001,97(1):25-31.

[6]劉曉莉,孫麗娜,喬德才.運動性氧應激與DNA損傷[J].中國運動醫學雜志,2006,25(3):332-333.

[7]Forrest VJ,Kang YH,McClain DE,et al.Oxidative stressinduced apoptosis prevented by Trolox[J].Free Redical Biology and Medicing,1994,16(5):675-684.

[8]熊正英,石磊,馬亞妮,等.幾丁質、幾丁聚糖對運動訓練小鼠肝組織自由基代謝及血清GPT活性的影響[J].體育科學,2001,21(4):62-64.

[9]張波,秦國華,孟紫強.二氧化硫對小鼠肺組織氧化損傷的效應[J].工業衛生與職業病,2004,30(4):212-215.

[10]Hammeren J,Powrs S,Lawler J.Exercise training–induced alterations in skeletal muscle oxidative and antioxidant enzyme activity in senescent rats[J].Int J Sports Med,1992,13(5):412-416.