頭孢拉宗與兩種氨基糖苷類抗菌藥物聯用對11株雙產酶陰溝腸桿菌的聯合藥敏研究

孫 艷，王 沭，邵曉迪，白 艷，王 睿（. 解放軍總醫院藥品保障中心，北京 0085；. 總后司令部管理保障局第三門診部，北京 0009；. 解放軍總醫院藥物臨床研究中心，北京 0085）

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae, EC）廣泛存在于自然界中，是人體腸道正常菌群之一，為常見的條件致病菌，既可通過外源性引起感染，也會由于機體免疫力降低，不合理使用抗菌藥物而引發內源性感染，引起呼吸道、尿道、傷口感染及敗血癥等[1-3]。陰溝腸桿菌產AmpC酶、超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）是對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的主要原因，少數的陰溝腸桿菌還會產碳青霉烯酶，或同時產生以上酶從而導致多重耐藥[4-5]，給臨床治療此類感染帶來極大挑戰。頭孢拉宗（cefbuperazone, CBPZ）是日本富山化學工業制藥株式會社研發的頭孢類抗菌劑，1985年首次在日本上市。頭孢拉宗是第三代頭霉素類抗菌藥物，對多種革蘭陰性菌具有較高的抗菌活性，具有7α-甲氧基取代基的頭霉素結構，使其對β-內酰胺酶穩定，對產β-內酰胺酶的細菌也有一定的抗菌活性。其作用機制與其他頭孢菌素類抗菌藥物相似，主要通過抑制細菌細胞壁的合成從而發揮殺菌作用[6]。雖然頭孢拉宗對產AmpC酶陰溝腸桿菌有效，但是對雙產酶陰溝腸桿菌尚不能完全抑制。氨基糖苷類藥物是具有氨基糖與氨基環醇結構的一類抗生素，臨床上主要用于治療敏感需氧革蘭陰性桿菌所致的全身感染。阿米卡星（amikacin, AMKC）、異帕米星（isepamicin,IPMC）均為氨基糖苷類抗菌藥物，對多數腸桿菌科細菌，如大腸埃希菌、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、變形桿菌屬等具有良好的抗菌作用。其對許多腸道革蘭陰性桿菌所產生的氨基糖苷類鈍化酶穩定，不會被此類酶鈍化而失去抗菌活性，交叉耐藥性少，而且這兩種抗生素與β-內酰胺類抗菌藥物等聯用具有協同作用。

因此，本實驗通過研究頭孢拉宗分別與阿米卡星和異帕米星對臨床分離的11株雙產酶陰溝腸桿菌的體外聯合抗菌效應，探討聯合應用頭孢拉宗與阿米卡星或異帕米星是否顯示協同作用，以期為臨床控制產酶陰溝腸桿菌的感染，合理聯用抗菌藥物時提供一定的實驗依據。

1 材料

1.1 菌株來源

11株來自中國人民解放軍總醫院2011年3月的陰溝腸桿菌非重復臨床分離菌株，全部來源于住院患者送檢的痰液臨床標本，采用雙紙片法檢驗，經鑒定為產ESBLs和AmpC酶陰溝腸桿菌。標準質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922（中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 培養基

Mueller-Hinton Broth（MH）營養肉湯（北京奧博星生物技術有限責任公司）；Mueller-Hinton Agar（MH）培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司）。

1.3 抗菌藥物

頭孢拉宗（韓諾株式會社，規格：0.2 g，批號：1026145）；阿米卡星（中國藥品生物制品檢定所，規格：100 mg，批號：130335-200204）；硫酸異帕米星注射液（旭化成制藥株式會社，規格：200 mg/2 mL，批號：EXA11CY）

1.4 儀器

比濁儀（法國梅里埃公司）；連續微量加樣器（美國Eppendorf公司）；八導微量加樣器（美國Eppendorf公司）；96孔平板（愛思進醫用塑料（臺州）有限公司）。

2 方法

2.1 菌懸液的配制

從已分純并過夜新鮮培養的細菌平板上挑取4 ～5個菌落，接種于MH肉湯中增菌6 h（恒溫，震蕩培養）。菌液用3 mLMH肉湯校正比濁儀濁度至0.5 MacFarland，再用MH肉湯稀釋至1. 5×105cfu·mL-1。

2.2 抗菌藥物儲備液的配制

精密稱取適量頭孢拉宗和阿米卡星，根據美國臨床實驗室標準化委員會CLSI（2012）以相應溶劑溶解，25 mL容量瓶中定容，含藥儲備液濃度均為1024 μg·mL-1，然后進行分裝冷藏，備用。硫酸異帕米星注射液直接分裝，配成1024 μg·mL-1含藥儲備液，冷藏備用。

2.3 測定方法

2.3.1 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC）的測定 用微量肉湯稀釋法測定單個藥物的MIC，以CLSI（2012）標準判讀敏感性；同時計算MIC范圍，半數抑菌濃度（MIC50），90%抑菌濃度（MIC90）和抑菌濃度幾何均數（MICG）。

2.3.2 FIC的測定 將頭孢拉宗以滅菌MH肉湯倍比稀釋成11個濃度，分別為256，128，64，32，……，0.5 μg·mL-1；阿米卡星和異帕米星以滅菌MH肉湯倍比稀釋成7個濃度，分別為16，8，4，2，……，0.25 μg·mL-1。將不同濃度的兩種抗菌藥物按棋盤法設計，兩兩組合加入96孔平板中，每種抗菌藥物取50 μL，再將1.5×105cfu·mL-1的菌液100 μL加入孔中，頭孢拉宗的最終濃度為64，32，16，8，……，0.125 μg·mL-1；阿米卡星和異帕米星的最終濃度為4，2，1，0.5，……，0.062 5 μg·mL-1；菌懸液最終濃度為7.5×104cfu·mL-1，37 ℃過夜（20±2） h培養。觀察結果，記錄單獨應用兩藥的最低抑菌濃度MIC甲藥單用和MIC乙藥單用，并選擇最佳組合效應時，兩藥聯合時各自的MIC甲藥聯用和MIC乙藥聯用，以計算FIC指數。

2.4 結果判定標準

2.4.1 MIC結果判定標準 采用微量肉湯稀釋法進行抗菌藥物最低抑菌濃度測定，無菌生長96孔平皿的最低藥物濃度為該藥對該株細菌的MIC。雙產酶陰溝腸桿菌對頭孢拉宗、阿米卡星和異帕米星的折點結果判定及質控菌ATCC25922質控范圍參考國外文獻及CLSI（2012）見表1。質控跟隨每批實驗，以確保整個實驗的準確性。

2.4.2 FIC指數的計算與判定標準[7]FIC指數 =MIC甲藥聯合/MIC甲藥單用+ MIC乙藥聯合/MIC乙藥單用。FIC≤0.5，協同作用；0.5 ＜ FIC ＜ 1，部分協同作用；FIC = 1，相加作用；1 ＜ FIC≤4，無關作用；FIC ＞ 4，拮抗作用。

表1 抗菌藥物MIC判定標準. μg·mL-1Tab 1 Interpretive standards for the values of MIC of antibacterials. μg·mL-1

3 結果

3.1 頭孢拉宗、阿米卡星和異帕米星單用對11株雙產酶陰溝腸桿菌的MIC及耐藥性

頭孢拉宗對雙產酶陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90分別是32 μg·mL-1和128 μg·mL-1，敏感率為45.45%，耐藥率為27.27%；阿米卡星對雙產酶陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90分別是2 μg·mL-1和4 μg·mL-1，異帕米星對雙產酶陰溝腸桿菌的MIC50和MIC90分別是0.25 μg·mL-1和1 μg·mL-1，敏感率高，且均為90.91%，耐藥率也相同，均為9.09%。具體見表2。

表2 頭孢拉宗、阿米卡星和異帕米星單用對雙產酶陰溝腸桿菌MIC及耐藥性. n = 11，μg·mL-1Tab 2 The results of MIC and drug resistance on CBPZ or AMKC or IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae.n = 11，μg·mL-1

3.2 頭孢拉宗與阿米卡星、異帕米星單用和聯用對11株雙產酶陰溝腸桿菌的MIC

單用頭孢拉宗對11株雙產酶陰溝腸桿菌的MIC50為32 μg·mL-1，聯用阿米卡星時，MIC50下降到4 μg·mL-1，聯用異帕米星時，MIC50下降到2 μg·mL-1。單用阿米卡星對11株雙產酶陰溝腸桿菌的MIC50為2 μg·mL-1，異帕米星的MIC50為0.25 μg·mL-1；與頭孢拉宗聯用，阿米卡星的MIC50下降到0.5 μg·mL-1，異帕米星的MIC50下降到0.125 μg·mL-1。具體見表3。

3.3 頭孢拉宗與阿米卡星或異帕米星聯合應用FIC指數分布

頭孢拉宗與阿米卡星聯用時，FIC≤0.5占27.27%，0.5 ＜ FIC ＜ 1占27.27%，FIC = 1占36.36%，1 ＜ FIC≤4占9.1%，FIC ＞ 4為0，說明頭孢拉宗與阿米卡星聯用對11株雙產酶陰溝腸桿菌多數以相加作用為主，無關較少，無拮抗作用；頭孢拉宗與異帕米星聯用時，FIC≤0.5占27.27%，0.5 ＜ FIC ＜ 1占54.55%，FIC = 1占9.09%，1 ＜ FIC≤4占9.09%，FIC＞ 4為0，說明頭孢拉宗與異帕米星聯用對11株雙產酶陰溝腸桿菌以部分協同作用為主，相加和無關作用較少，無拮抗作用。具體見圖1。

表3 頭孢拉宗與阿米卡星、異帕米星單用和聯用對雙產酶陰溝腸桿菌的MIC值. n = 11，μg·mL-1Tab 3 The values of MICs of CBPZ alone or combined with AMKC or IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae.n = 11，μg·mL-1

圖1 聯合抗菌藥物的FIC指數分布. n = 11Fig 1 The percent distribution of FIC of CBPZ and AMKC or IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae. n = 11

3.4 頭孢拉宗與阿米卡星、異帕米星單用和聯用對11株雙產酶陰溝腸桿菌的濃度-累積抑菌百分率曲線

與單用相比，頭孢拉宗與阿米卡星和異帕米星聯用的累積抑菌百分率曲線明顯左移，表明在相同累積抑菌百分率下，兩藥聯合應用比兩藥單獨應用所需的藥物濃度低；在相同的給藥濃度下，聯合用藥比單獨用藥具有更高的抗菌效應。具體見圖2和圖3。

圖2 頭孢拉宗與阿米卡星單用和聯用對雙產酶陰溝腸桿菌的濃度-累積抑菌百分率曲線Fig 2 The concentration accumulated inhibition percentage curve of the antibacterial activity of CBPZ combined with AMKC against distocia enzyme Enterobacter cloacae

圖3 頭孢拉宗與異帕米星單用和聯用對雙產酶陰溝腸桿菌的濃度-累積抑菌百分率曲線Fig 3 The concentration accumulated inhibition percentage curve of the antibacterial activity of CBPZ combined with IPMC against distocia enzyme Enterobacter cloacae

4 討論

近年來，雙產酶陰溝腸桿菌不僅對除碳青霉烯類外的其他β-內酰胺類抗菌藥物耐藥率極高，對非β-內酰胺類抗菌藥物如慶大霉素、阿米卡星和環丙沙星的耐藥性也顯著高于單純高產AmpC酶或單純產ESBLs的陰溝腸桿菌，其多重耐藥性非常嚴重。

頭孢拉宗是第三代頭霉素類抗菌藥物，抗菌譜有所擴大，耐酶性強，對多種革蘭陰性菌具有較高的抗菌活性，特別是對大腸埃希菌、克雷伯菌屬、檸檬酸菌屬、腸桿菌屬、沙雷菌屬和吲哚陽性變形桿菌有良好的抗菌力。其對革蘭陰性菌的體外抗菌活性大多優于頭孢西丁、頭孢美唑等。頭孢拉宗對各種細菌產生的β-內酰胺酶極為穩定，對β-內酰胺酶產生菌也有強大的抗菌作用。

異帕米星是慶大霉素B的1-N-HABA衍生物，具有與阿米卡星相似的抗菌活性，適用于治療對其他氨基糖苷類藥物、包括對阿米卡星耐藥的革蘭陰性桿菌（包括雙產酶陰溝腸桿菌）和葡萄球菌所致的嚴重感染[8-9]。異帕米星具有顯著的抗生素后效應，維持并加強了氨基糖苷類藥物的優勢，具有強效殺菌活性、致耐藥性低以及毒副作用小和具有良好的抗生素后效應等特點，廣泛用于各類細菌感染的治療。

本研究對11株雙產酶陰溝腸桿菌的體外聯合藥敏實驗結果表明，頭孢拉宗與阿米卡星或異帕米星聯用可顯著降低單獨應用時的MIC，聯合應用后比單獨應用時的濃度-累積抑菌百分率曲線明顯左移，效應增強，以部分協同和相加作用為主,說明兩種藥物聯用對雙產酶陰溝腸桿菌具有較好的體外抗菌活性。因此，在治療由雙產酶陰溝腸桿菌導致的感染時，可以考慮采用頭孢拉宗與阿米卡星或異帕米星聯合應用。

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